药物定量分析与分析方法验证详解演示文稿.pptVIP

（一）蛋白质的去除（续3） 3、加入强酸： 当溶液的pH低于蛋白质的等电点，蛋白质为阳离子状态，可与酸根阴离子结合而形成沉淀析出。 常用的强酸有10%的三氯乙酸（或三氟乙酸）等，比例为血浆/强酸=1：0.6左右混合，高速离心后，可去除90%以上蛋白质。 第六十页，共八十页。 （一）蛋白质的去除（续4） 4、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂： 当pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带负电荷的羧酸与金属阳离子形成不溶性沉淀 常用的沉淀剂有：CuSO4和ZnSO4等，混合的比例为血浆/沉淀剂=1：2，然后高速离心。 第六十一页，共八十页。 （一）蛋白质的去除（续5） 5、酶解法： 在测定某些与蛋白质结合牢固、且对算不稳定的药物时，常加入一些酶而使得蛋白质分解，将药物释放出来。 常用的是枯草菌溶素。但也可以根据药物的不同选择合适的分解酶。 该法操作简单，效果较好。但很多酶的价格很高，且不易获得是其缺点。 第六十二页，共八十页。 （二）缀合物的水解 药物进入体内后，被免疫系统当作异物而代谢掉，其中一些含有羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性的葡萄糖醛酸或葡萄糖酸酐等结合，形成极性大的无活性的缀合物。 在测定尿液中药物的总量时，需要用适当的方法水解，然后再进行测定。其中酸水解法简便、快速，但专一性差、药物易分解；酶水解法专一性较强、药物无分解；但时间长、费用大，对于遇酸及受热不稳定的药物，可采用酶水解法。 第六十三页，共八十页。 （三）有机破坏 生物样品中的金属原子常与蛋白质结合，难以用有机溶剂萃取，测定时多采取有机破坏的方法进行，如使用硝酸-高氯酸作为消解剂，将有机部分破坏掉，使得金属原子被转变成高价态的离子部分。 第六十四页，共八十页。 （四）分离、纯化和富集 样品的浓度高低对于前处理的影响很大。 如果样品浓度较高（ug/ml及其以上），所采用的方法灵敏度可达到要求，那么样品在简单处理（如沉淀蛋白或缀合物水解）后即可直接进行测定。 在很多情况下，生物样品中药物的浓度很低（ng/ml及其以下），很多仪器条件（如UV检测）的灵敏度不够，此时需要将样品进行分离、纯化和富集，以达到分析的要求。 第六十五页，共八十页。 （四）分离、纯化和富集（续1） 萃取法是应用最多的分离、纯化方法。目的是从大量样品中提取出所需要的微量组分，然后通过溶剂的蒸发而使得样品得到富集。 萃取方法包括： 液液萃取法：经典方法； 液固萃取法；发展迅速方法。 第六十六页，共八十页。 1、液液萃取法（LLE） 液液萃取法（Liquid-Liquid extraction，LLE）适用于极性相对较小的药物，由于这些药物在有机溶剂中的溶解度（远远）大于在水相中的溶解度，而水相中的大多数内源性物质极性较大，根据相似相溶原理，可以用有机溶剂将小极性药物从水相中萃取出来，同时可以除去大部分的干扰物质，包括大量蛋白质等。 该方法是传统方法，仍在大量使用。 第六十七页，共八十页。 1、液液萃取法（续1） LLE需要考虑有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积，以及水相的pH值等。 所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大（能提取完全），沸点低（易于蒸发或挥发除去），与水不相混溶（容易分离）、无毒（苯类溶剂不要用）、化学稳定（不易燃、不爆炸）、不易乳化（影响萃取效果）等。最常用的是乙醚和三氯甲烷（先难以购买，可用二氯甲烷替代）。 第六十八页，共八十页。 1、液液萃取法（续2） 所用的有机溶剂要适量，一般有机相与水相（液体样品）的容积比为1：1或2：1，也可根据实际情况进行确定。 如果有机溶剂体积过大，后续的挥发时间较长；体积过小，则可能提取不完全，影响测定结果的准确性。 第六十九页，共八十页。 1、液液萃取法（续3） 溶液的pH值对与LLE的影响非常大。 多数药物是亲脂性的碱性药物，内源性物质多为酸性，所以在碱性条件下提取药物，可以使得药物呈原型状态而被易于提取出来，而内源性物质则留在水相中。可用适当碱性溶液（如碳酸氢钠-氢氧化钠的混合液作为碱化试剂） 一般情况下，有机溶剂的萃取只萃取一次。 第七十页，共八十页。 1、液液萃取法（续4） LLE的优点是选择性好，操作简单，成本低。大多数的药物都可以与内源性物质得以分离，对结果的干扰较小。但该法不适合于极性大的药物的分离和纯化。 第七十一页，共八十页。 2、液固萃取法（LSE） 液固萃取法（Liquid-Solid extraction，LSE）是近年来发展非常迅速的方法，主要采用柱色谱分离方法，将具有吸附、分配和离子交换性质的固定相作成萃取小柱，将生物样品通过此小柱，可以用适当溶剂将干扰物洗脱掉，将药物保留在固定相上，再用适当的溶剂洗脱下来进行分析。 第七十二页，共八十页。 2、液固萃取法（续1） LSE的特点： 引入杂质较少，样品洗脱