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.材料与方法L1检测样品的制备
2c3株抗牛安氏隐抱子虫卵囊壁特异性单抗，其制备和纯化方法参照文献。标准阳性粪 便，采自粪栓阳性牛粪；标准阴性粪便，为经3次不同时间采粪便集虫后，抗酸染色卵囊均 为阴性的牛粪，交叉反响粪便，为集虫粪检仅球虫或结肠小袋纤毛虫感染而无隐袍子虫感染 的牛粪。
酶标单克隆抗体的制备，参照文献［2：进行，其克分子比为1. 96o被险粪便处理方法:取粪2克加入含0. 1%聚山梨酸20及2mlnol/L乙二胺四乙酸的磷酸缓 冲盐溶液5nli碾碎后过滤备用。
14双抗夹心E L I S A法工作程序
聚乙烯反响板经0.0025%的戊二醛溶液等处理后，使其更易与抗原或抗体结合.置4℃ 冰箱备用。包被液适当稀释兔抗体（I gG）,于微量酶标板每孔加100 u 1,置4℃过夜后，用洗 涤液洗3次。每孔加待测样品100u 1 ,同时设阴性和试剂空白比照，放置37C反响2 h,用洗涤 液洗3次。每孔加适当稀释的酶标抗体100皿置37。。反响2 h,用洗涤液洗涤3次。每孔加底物 溶液100U 1 ,室温暗处放置20m i n显色，每孔加中止反响液50 u 1。然后在酶标测定仪上测 定490nm处的0 D值。以样品孔的0 D值（P）与阴性比照孔的0 D值（N）之比大于2（即P/ N2）时定为阳性。
L5,双抗夹心E L I S A法工作浓度确实定
通过交叉连续稀释分析法确定用于检测肯定浓度抗原所需兔抗体（I g G）和酶标抗体 的工作浓度。兔抗体（I g G）浓度分别为25n g/m 1、50n g/m 1、75 n g/m 1 lOOn g/m 1 ;虫卵浓度分别为IO、io6、］o5、I。，i03和个/m 1 o酶标抗体的稀释度分别为 1： 50、1:100、1:200、1:400、l:800o在工作浓度选择中，以P/N2时,兔抗体（I g G）浓度 最低、酶标抗体稀释度最高为最适条件。
1. 6.最正确反响条件确定
经方阵滴定，确定单抗和酶标单抗的员适工作浓度分别为1： 400和1280倍比稀释。加入 粪样和酶结合物孵育的时间可缩短至3min。除加入酶结合物反响后洗涤5次外，其余洗涤次 数均为3次，洗涤时间可结至10s。
1. 7.阻断试验
将单抗1： 100稀释.1ml分装于各试管，将标准阳性粪便悬液从原液稀释至512倍并加入试 管内，37℃水浴30 min. 60g离心30 min.除去沉淀物，孵育后的粪便标本进行双抗夹心 —ELISA,1. 8.交叉反响试验
对4份有Eimeria bovis卵囊而无隐袍子虫卵囊的牛粪和5份有而无隐抱子虫卵囊的牛类 按前述方法处理后进行ELISA。
1. 9.重复性试验
对相同样品不同批次进行检测。
1. 10.敏感性试验
对假设干牛粪样分别进行抗酸染色和ELISA检测，对检测结果进行比拟。
2结果抗牛安氏隐胞子虫单抗（I gG）和酶标兔抗牛安氏隐抱子虫抗体最正确工作浓度确实定通 过点阵分析法，在满意选择条件下，本试验兔抗体（I g G）工作浓度为 n g/m 1 ,酶标抗体 稀释倍数1:400是E L I S A测定方法的最正确工作浓度。
双抗夹心E L I S A特性的测定
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