抗体工程参考答案.docx

一、 抗原：任何进入人或动物体内后，能和抗体结合或和淋巴细胞的表面受体结合，引起人或动物免疫反应的物质。 抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 亲和层析：将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。 抗体库：在原核系统功能性表达多样性抗体基因。 多克隆抗体：指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。 杂交细胞：融合细胞含有两个不同的细胞核，成为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞。 二、 Fab：抗原结合片段 Fc ：可结晶片段 Ag：抗原 Ab：抗体 Elisa：酶联免疫吸附试验McAb：单克隆抗体 IgG和IgM：免疫球蛋白G，免疫球蛋白M HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 TK：胸腺嘧啶核苷激酶 HVR超变区 CDR互补决定区 FR骨架区 APC抗原提呈细胞 PcAb多克隆抗体 DC树突状细胞 M 巨噬细胞 ScFV单链抗体三、 1、简述单克隆抗体的制备过程： （详细看第三章第29个PPT） 生物制药的《抗体制药》那一章，大家也可以看一下，内容简洁明了…… 单克隆抗体的制备 （一）杂交瘤细胞的大量繁殖 克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内 杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特 性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000 倍。 利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。 材料 经高压灭菌的降植烷。 Balb/c 鼠：5~8 周龄。 杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。 RPMI—1640 培养液 新生牛血清 操作方法 于小鼠腹腔注射 0.5ml 降植烷，注射后１～９周内种植细胞。 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640 液洗涤一次，1 000r/min 离心 10min 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640 液配成 1.0×107 细胞/ml 的悬液。 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含 1.0×107 个细胞/ml）。 接种后 10 天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3 天取 1 次，可取10 次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。 （二）单克隆抗体的提纯 1．材料 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl 缓冲液20 mMol/L NaCl 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl 缓冲液40mMol/L NaCl 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl 缓冲液80 mMol/L NaCl 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl 缓冲液 饱和硫酸铵液 DEAE—纤维素柱2．操作方法 小鼠腹水用冷 PBS 液稀释 4 倍后，于 1.00×105 转离心 30min，去沉淀。 在 4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。 此溶液置冰中 30min~60min，然后 5 000r/min 离心 10min，去上清。 将沉淀溶于 Tris－HCl 缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。 装入透析袋于 Tris－HCl 缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。 离心去沉淀。 溶液稀释（1:100 或更高倍稀释）后，于 280nm 测蛋白含量，估计蛋白质含量280unit=0.8mg 蛋白质 一般每 ml 腹水中，含有总蛋白约 25mg~36mg。 过 DEAE—纤维素柱：纤维素柱高 40cm，以 20mMol/L NaCl Tris 缓冲液平衡。透析样品以 Tris 缓冲液等量稀释。 样品进入柱床速度为 1ml~2ml/min，以 NaCl 线形梯度洗脱。大部分单克隆 IgG 于 40 mMol/ L 和 80mMol/L NaCl 洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl 洗脱。 测 OD 280nm 收集蛋白峰，单克隆 IgG 保存备用。 杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG 和 IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫 程序。免疫一次，且 3 天后就取脾，多为产生 IgM 的 B 淋巴细胞。免疫多次