实验十一 大肠杆菌基因组DNA的提取.docxVIP

实验十大肠杆菌基因组DNA的提取一实验目的 掌握大肠杆菌基因组DNA提取的方法和原理二实验原理 大肠杆菌为革兰氏阴性菌，细胞壁比拟薄。SDS是一种阴离子去垢剂，能够破坏 细菌的细胞壁和细胞膜。在反响体系中加入终浓度约为1%的SDS 37度水浴1 小时就可以完成大肠杆菌的裂解；蛋白质K降解蛋白质；酚/氯仿/异戊醇抽提去 除变性的蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀即为基因组DNA。SDS具有的主 要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2） 有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3） SDS能与蛋白质结合成为 RI—0—SO3R2一蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。用蛋白酶K消化 蛋白质，能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质。 三实验仪器、材料和试剂 （-）实验仪器和用具1恒温摇床 2涡旋振荡器3台式离心机 250 ml三角瓶1.5 ml离心管 枪头（1000 nk 100 W 和 10 M）100 ml试剂瓶 （二）实验材料大肠杆菌 （三）实验试剂1LB培养基：1%的胰蛋白陈，0.5%的酵母膏，l%NaQ 2TE 缓冲液：10mMTris-cl （pH8.0）, 1 mM EDTA（pH8.0）蛋白酶 K （20 mg/ml） 4苯酚氯仿异戊醇（25:24:1）5氯仿异戊醇（24:1） 6-20℃预冷的无水乙醇7 70%乙醇 8裂解缓冲液(10ml) 10 ml裂解缓冲液=8.94 ml TE缓冲液+1 ml 10% SDS+60 pil蛋白酶K (20 mg/ml)9 KAc (3M, pH8.0) 四实验步骤： 1 IX 3 ml过夜培养(12-16 ht)的大肠杆菌菌液分两次加入1.5 ml离心管中，12000 g离心1 min收集菌体；2尽可能去上清,加入600 口裂解液使菌体重悬,涡旋振荡混匀后37c温育1 h； 3加入等体积的苯酚氯仿异戊醇，缓慢上下颠倒5 min使之完全混匀； 4. 10000 g离心5 min,离心后在水层(DNA层)和有机层(苯酚/氯仿/异戊醇) 之间有一白色蛋白质分隔层；5用尖端剪短约2 mm的1 ml枪头小心转移上清至新的离心管中，加入等体积 的氯仿/异戊醇以除去苯酚，颠倒混匀，最高速离心2min； 6移上清至新的离心管中，加入1/10体积3M醋酸钾(pH8.0)和2倍体积-20℃预 冷的无水乙醇轻轻混匀，可见DNA絮状沉淀，可将絮状物用100山枪头挑到新 的离心管中，或者4c高速离心5 min后弃去上清；7加入1 ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀，12000 g离心5 min,小心弃去上清，用 枪头吸取剩余的乙醇； 8室温下风干DNA沉淀10 min (可微微斜靠在吸水纸上)，为快速风干可置于 超净工作台上吹干；用适量的TE缓冲液溶解DNA。 五考前须知1菌液离心后，尽可能去上清。 2苯酚是一种强酸，可引起严重的烧伤；氯仿是一种致癌物，操作时应穿实验服, 戴上手套并保持管盖盖好。为平安起见，最好在通风橱里操作。 3假设提取的基因组DNA仅用于PCR检测，裂解液中RNaseA可以不必添加。 4SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。 以免影响下一步RNase的作用。 六思考题1酚/氯仿/异戊醇抽提时为什么不能剧烈振荡离心管?