手把手教你无缝连接引物设计.docxVIP

无缝连接——解放你的重组质粒构建 ——以pET-28a为例 懒人推动世界的进步，这是真理。无缝连接就绝对是一个想偷懒的科学家创造的。抛弃 了传统切切切和接接接，只需要PCR的扩扩扩，尤其有了能够扩增长片段的pfu酶加持， 目的基因、载体统统扩增出来，15分钟同源重组完成，理想中的一步质粒构建终于实现。无 需考虑载体的酶切位点，想插入那个位点都可以，多克隆位点成了笑话。自然也不需要限制 性内切酶，连接酶，生产这些酶的公司未来也要game over,只有PCR笑到了最后。 但是无缝连接也是有逼格的，对引物有特殊的要求，好在友好的在线软件又一次拯救世 界，软件在哪里，怎么使用，来来来，老司机手把手教你，分分钟搞定。 我们以表达质粒pET-28a作为载体，基因A作为目的片段图示。 1、翻开在线设计网站（宝生物 Primer design and other tools ） s:〃 （打 不开超链接请自行复制）（gTahaRa…q ! ?PrBiCts Lcanwig ? DocscntMoPPOOVCTS S6RVK C$4. SUPPORT LCAM4H4C CENTERS APPUg2Ms ABOUT CONTACT U$ Clontech TaKdRa cellartisPrimer design and other tools修S Primer design and other tools 修Sprovtgto help vow …VO? aonre expenments pwen totcv hmahrmh cftwnig or tor ywlaMiton. dMnn. fROUccmt*) wth nur pnmef loa 3cMMo l?ut vertex guuf noieru SeniMc ?w lnFuMxi Ckr09 Cvc! w?i S?pUcnc ioftwu Primer design and other tools修Sprovtgto help vow …VO? aonre expenmentspwen totcv hmahrmh cftwnig or tor ywlaMiton. dMnn. Primer design and other tools 修Sprovtgto help vow …VO? aonre expenments pwen totcv hmahrmh cftwnig or tor ywlaMiton. dMnn. fROUccmt*) wth nur pnmef loa 3cMMo l?ut vertex guuf noieru SeniMc ?w lnFuMxi Ckr09 Cvc! w?i S?pUcnc ioftwu Oe^gn your pdmers Otf NFA in-FiAor Cc?v)9 Pnmct Dc?*gn Ted tor *中4 or rrUtpk-?ncd clonrg KconmcxM? mxxig vwcrc PC^ y49m E cnaUcj 加 rmAagctc .皿 ONAut v?x/ elix Krum mfTM to Q**W41* W yffc.f rwwiQf Miv in tn/ 0;：z 5rM wm to ?~e 小 fvwtd ?rwt dMtjnnQ yourwMra ciofung In-Fmofl c l Mm how to our ortinc tod QixMy nd ai—KFmmeQja： O Ocrang omgi 2、Launch,进入设计页面，可以构建重组载体（cloning ）,也可以设计点突变 （mutagenesis）,我们今天先学习下重组克隆构建。 Obp 3、输入载体序列(Destination vector),这里有个bug要注意，你的载体序列的方向要正 确，换句说，启动子的方向和你的基因方向一致。以pET-28a为例，从下列图可知道，它的启 动子是反向插入载体的，多克隆位点XholNcol是与启动子相反的。 Bpu1IO2l：dO)Dra 111(5127)?90%5358；Xho 1(1 M)Not l(16S) E”Hind 111(173)Sal l(m SacEcoR 1(192) BamH j Nhe 1(231) ? Nde l( Bpu1IO2l：dO) Dra 111(5127) ?90%5358； Xho 1(1 M) Not l(16S) E” Hind 111(173) Sal l(m Sac EcoR 1(192) BamH j Nhe 1(231) ? Nde l(23t) NCO l(2M) Xt?K335) /Bgl II(4OI 、；SgrA 1(44