哈尔滨地区鸡球虫种类调查及柔嫩艾美耳球虫3-1E基因的原核表达.docx

哈尔滨地域鸡球虫种类检查及柔嫩艾美耳球虫3-1E基因的原核 表达 鸡球虫病是造成现在世界养鸡业各样损失的主要原因之一。其危害很大,轻 则造成鸡的生长发育受阻、生产性能下降。 重则造成鸡的大批死亡,尤其是鸡雏阶段,15～50日龄的鸡雏发病率高,死 亡率高达80%。随着集约化养殖业的发展和鸡对化学疗法抵挡力的增强以及虫株 耐药性和药物的污染等,致使本病的危害日趋严重,因此,做好鸡球虫流行病学调 查关于该病的防治拥有重要的意义。 基于此,本研究对哈尔滨地域鸡球虫的病原的种类及流行情况进行了较为详 细的检查研究。此外针对致病性较强的优势虫种柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella),选择了艾美耳球虫各虫种间保守性较高的3-1E基因进行克隆和原核 表达,为探讨该重组蛋白是否能够作为鸡球虫基因工程疫苗免疫预防研究确立了 基础。 对哈尔滨地域218个鸡场进行了检查,粪便检查显示有136个鸡场感染艾美耳球虫,感染率为62.39%。其中呼兰区和香坊区感染率高达80%以上。 同时经过显微镜检查,依据鸡球虫各虫种的基本特点,判定哈尔滨地域鸡球虫感染的种类共有6种,分别为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、迫害艾美耳球虫 (E.necatrix)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、 早熟艾美耳球虫(E.praecox)以及缓和艾美耳球虫(E.mitis)。2.因鸡球虫在自 然感染的情况下,多为混淆感染。 本研究在检查哈尔滨地域鸡球虫感染时,发现各检查点均为5种或5种以上 的球虫感染,且均有柔嫩艾美耳球虫感染,感染率较高,达39.83%;在100×倍显 微镜下察看球虫卵囊数量,随机计数每个粪样的5个视野,其卵囊总数的平均值 作为感染强度的判断依据,结果显示哈尔滨地域球虫处于轻度和中等强度感染, 应适合地做好防治举措;从感染的不同日龄看,0～30日龄的鸡雏球虫感染率达 到了40.00%,而30～60日龄鸡感染率最高,达76.47%。3.经过单卵囊分别技术成 功的分别了哈尔滨地域6种鸡艾美耳球虫,分别为柔嫩艾美耳球虫、迫害艾美耳 球虫、堆型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、缓和艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫 (E.brunetti)。 4.应用巢式PCR技术成功的对分别的哈尔滨地域鸡艾美耳球虫的ITS1区进 行了种株判定,同时对克隆测序的所有艾美耳球虫种株进行了同源性剖析和系统 进化剖析。5.应用RT-PCR技术扩增出柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株子孢子3-1E基因 片段,结果表示,3-1E基因含有一个开放阅读框(ORF),长513bp。 对此基因片段进行克隆,经判定正确后,亚克隆到表达载体pET-32a(+)上, 在受体菌Rosetta进行了原核表达。经SDS电泳剖析显示交融蛋白主要存 在于上清中,为可溶性表达。 Westen-blot剖析表示表达的蛋白可被感染柔嫩艾美耳球虫鸡的阳性血清 特异性辨别。