《流式细胞术培训》PPT课件.pptVIP

流感及其疾病 流感的特点 一种由不断变异的病原导致的疾病 一种最易传播、最难控制的疾病 一种经常横扫全球肆虐人类的疾病 一种最善变，早期难于诊断的疾病 人类历史记载的流感世界性大流行 流感:全球灾难性疾病 Murphy B.R., Webster R.G., Virology, IInd edition, New York, 1990, 1091-2 Ghendon Y. Introduction to pandemic influenza through history Eur Jour of Epid, 1994;10: 451-453 中世纪 1781 1830 1918 1933 1957 1968 1977 亚洲流感 香港流感 俄罗斯 流感 首次分离人类流感病毒 西班亚流感导致二千至四千万人死亡 流感从亚洲开始横扫俄罗斯 记载数次流感流行 希多克拉底最早记载 流感流行 流感流行史 历史上的流感大流行 质量控制： 变异系数（CV）：流式细胞仪的“分辨率”。 Tip：获取高质量数据的关键在于获得小的CV值。 （3）用流式细胞仪发现的侧群细胞（SP Cell） Hoechst 33258 AT Chromomycin A3 GC 2 4 5 6 X 8 9-12 7 recip 9-22 13 14 15 16 17 Y 18 20 19 22 21 Ph 1 / 3 1 3 (4)染色体核型 制备和设计流式样本 制取单细胞悬浮液 荧光染色 上机检测 数据分析 机械破碎，酶解消化，化学解聚—去除碎步与团块 细胞吸收的荧光染料与其目标分子含量成正比，荧光信号强度与吸收的荧光染料分子成正比 仪器校准和优化 结合生理现象分析数据 实验流程 荧光染色设计的几个原则 了解仪器的激光/滤光片的组合 匹配荧光亮度与最低密度的目标分子 了解所用荧光染料的激发和发射谱 减小荧光光谱重叠 使用多杆激光，但需避免多重激发 小心使用组合染料（tandem dyes） 设定合适的对照样本（调节荧光补偿的样本） （1）荧光补偿 发射光谱重叠带来干扰，需要将其进行补偿 Jerry Barnhart CD45 FITC信号“渗漏” 到PE探测通道，CD4 PE信号微弱的细胞不能被区分出来 CD45PercP信号不“渗漏”到PE探测通道，CD4 PE信号微弱的细胞被识别出来。 Jerry Barnhart （2）了解染料光谱，合理选择组合多种荧光 （3）选择多杆激光，但注意避免双重激发 561nm激发光可更好的激发PE，但不能激发FITC，因此可避免荧光补偿。 Jerry Barnhart CD19 FITC 小时 AmCyan+ AmCyan- 多重激发导致荧光信号“渗漏”，降低分辨力 AmCyan：紫光及蓝光激发 FITC：蓝光激发 Jerry Barnhart （4）使用组合染料需考虑其技术限制 PE CD8 PE-Cy7 CD3 PE-Cy5 0小时 2小时 小时 (Alan StallKen Davis) 不稳定性 APC通道假阳性 无假阳性 PE通道假阳性 PE通道假阳性 无假阳性 APC通道假阳性 假阳性影响 -APC-CY7 + PE-Cy7 + APC-CY7 -PE-Cy7 （Jerry Barnhart） + APC-CY7 +PE-Cy7 流式细胞术的新进展 一. 流式细胞术法发展状况 仪器技术：90年代后期，现在已相对成熟； 试剂，染料：取得很大进展，目前类型已非常丰富，但商业化普及有所不足； 数据分析技术：远滞后于前两者，可能成为将来流式技术最大的进步。 二. 新应用 数据分析技术： 高内容的多参数空间要求更有效的聚类算法； k-均值聚类--混合高斯模型 特异性磷酸化蛋白多色检测试剂。 胞内及表面染色：如MAPK，JNK，Erk，JAK/Stat等 信号通路动力学，测绘信号网络； 基本机制研究；相关疾病诊断与治疗。 在当今系统生物学时代，了解蛋白相互作用的网络，多参数流式细胞仪可成为一种关键性的工具。 多参数流式细胞术改变了对抗原特异性T细胞反应的认识。 多维的免疫关联性只能由多参数流式细胞术揭示。 量子点染料技术得到大量应用。 量子点染料与传统抗体交联：高亮，发射峰狭窄，更好的染色分辨率，更大的实验设计空间。 Beckman-Coulter的新流式细胞仪-2009年下半年。 谢 谢 BD FACSCalibur BD FACSAria II BD FACSVantage Diva BeckMan-Coulter MoFlo? XDP B