实验植物基因组的提取.ppt

第1页，共24页，2022年，5月20日，22点17分，星期三 第一部分 植物基因组DNA的提取 第2页，共24页，2022年，5月20日，22点17分，星期三 一、实验目的和要求 1、学习并掌握植物基因组DNA的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析。 第3页，共24页，2022年，5月20日，22点17分，星期三 二、实验基本原理 植物基因组DNA的提取一般经过破碎细胞壁、裂解细胞膜、除去多糖和酚等次生物质、变性蛋白质、沉淀核酸、去除RNA和浓缩DNA等几个步骤。 传统提取方法主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB)法、十二烷基硫酸钠 (SDS)法。其基本原理是：十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，加入RNA酶去除核酸中的RNA,即得植物基因组 DNA溶液。 由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的CTAB-DNA提取法步骤多，较烦琐，DNA产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。SDS法操作简单，温和,也可提取到较高分子量DNA，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响DNA的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 第4页，共24页，2022年，5月20日，22点17分，星期三 本实验采用十二烷基硫酸钠 (SDS)法提取植物基因组DNA，基因组DNA提取后，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA分子量大小、纯度；用紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量。 DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定: DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。 第5页，共24页，2022年，5月20日，22点17分，星期三 影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有： ⑴ DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分 子量越大，迁移率越小。 ⑵ DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA ⑶ 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度 为1％～2％； ⑷ 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm） （电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行 高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 ⑸ EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增 加。 ⑹ 电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们 各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。 TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用 TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护 DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 ⑺ 碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大 第6页，共24页，2022年，5月20日，22点17分，星期三 在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题： （1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。 （2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。