红毛菜科红藻的遗传育种与功能基因研究.docxVIP

红毛菜科红藻的遗传育种与功能基因研究 海藻营养丰富,味道鲜美,且在制药、工业等领域都有宽泛应用,因此市场对 于海藻的需求不断增加。这一现象使我国海藻养殖业正在经历从稳步增长到快速 增长的转变,养殖规模不断扩大,养殖技术也在不断优化更新,养殖品种更为多元 化,条斑紫菜(Pyropiayezoensis)、坛紫菜(Pyropiahaitanensis)红毛菜 (Bangia)、海带(SaccharinaJaponica)、羊栖菜(Hizikiafusifarme)等。 本研究以同属红毛菜科红藻的条斑紫菜和红毛菜为实验材料,经过分子克隆 和标记以及低盐胁迫的方法,针对随着海藻养殖业的发展而出现的一些问题进行 了探究,以期为丰富北方海藻种质资源和更深入地认识其抗逆性生理生化响应提 供依据。实验结果表示:以条斑紫菜优质品系为比较,不同海区栽培的“黄优1 号”品系与野生亲本在各生化组分(藻胆蛋白、叶绿素a、类胡萝卜素和可溶性 蛋白)含量上有显然差别。 “黄优1号”在不同海区栽培藻体的藻胆蛋白含量均高于其亲本“野生群体 1”,其中于日照海区培育的品系1b的各类藻胆蛋白的含量最高,呈显著性差别 (plt;0.05),而相较于作为同海区优质条斑紫菜“比较品系”略低,但差别不显 著(pgt;0.05)。而关于叶绿素a(Chla)和类胡萝卜素(Car)含量来说,“黄优1 号”中来自日照的培育品系1b的各物质含量皆显著高于其亲本和其余培育品系 以及来自同海区的优质条斑紫菜(plt;0.05)。 关于可溶性蛋白(TSPs)来说,虽分为两个子集,但日照培育的“黄优1号”含 量仍旧最高,但与比较和野生2品系差别不显著(pgt;0.05)。而同在南通海疆栽 培的“黄优1号”和培育品系2的各物质含量相差不大。 以上结果说明,从野生群体中用合适的选育手段培育品质更佳的栽培品系 (群体)拥有可行性。而不同海区对“黄优1号”栽培藻体的品质有很大影响,其 中于日照进行栽培的“黄优1号”藻体品质最正确。 我们推断,来自北方的紫菜种质不适于生长在温度相差较大的南方海疆,而 日照海区的环境条件更适合“黄优1号”的生长。为做进一步认识,采用rbcL 和COⅠ基因特异性扩增和AFLP分子标记技术对“黄优1号”条斑紫菜的遗传多样性进行了探究。 基因扩增结果表示,鉴于rbcL序列(约1200bp)仅砣矶岛养殖绳上全沉水生长的野生紫菜群体与其他品系(群体)拥有1.1%的遗传差别,COⅠ序列(680bp) 也仅南通栽培的两个品系出现两个碱基的变异,其他品系(群体)与比较条斑紫菜 序列完全一致。而AFLP分子标记结果用7对引物扩增出了249条清晰条带,其有 248条为多态性条带,多态性百分比高达99.6%。 遗传多样性剖析显示,两个野生群体Wild1、2的多态性最高,分别为47.39% 和59.44%;三代“黄优1号”及两个比较组的多态性均在区间[20.08%,24.50%] 内。聚类剖析结果表示,大多数群体间遗传距离较为邻近,多介于[0.0181,0.0758] 内,而同为“黄优1号”的崂山栽培群体HYF2L和比较群体Control2与其余群体间的遗传距离较远,多介于[0.1325,0.2527]内,剖析获得各群体间的遗传距离与养殖方式相关。 由于同为全沉水生活方式的群体间遗传距离也相隔较远,我们推断:全沉水 生活方式在条斑紫菜遗传多样性上起到了重点性的作用。用RACE方法成功克隆了质膜H+-ATPase基因PMHA1,5’-RACE与3’-RACE各获得一条光亮的特异性条带,长度分别为1000bp和1800bp。 拼接后,获得全长为3368bp的PMHA1基因cDNA,含有一个3129bp长的开 放阅读框,编码1042个氨基酸,分子量为106.51kD。综合其理化性质剖析,预 测的蛋白共包含29个α螺旋和35个β折叠以及19个蛋白激酶C、1个糖基化位 点和3个氨基化位点以及77个磷酸化位点且散布复杂。 我们将红毛菜的PMHA1蛋白与其他13个物种同源蛋白进行了比较剖析,结果 显示物种之间有一定的相像性,但红毛菜质膜H+-ATPase基因的差别较大。综合 上述结果,我们推断较多的磷酸化位点会让红毛菜藻体受到外界胁迫刺激后,该 蛋白的活性快速提高,敏捷度高。 其拥有P型H+-ATPase家族的特点序列和保守构造域,但未发现与之匹配度 高的同源序列。为了认识PMHA1的表达特点,应用实时荧光定量PCR方法检测该 基因在不同程度的低盐胁迫下的红毛菜PMHA1基因相对表达量的变化,获得结果, 该基因在不同程度的低盐胁迫下,表达量也显然发生改变,出现随海水占比减少 表达量升高的趋势,且在同一盐度胁迫下,表达量随胁迫时间增长先升后降。 综合上述结果我们发现,为了抵抗外界环境胁迫,红毛菜藻体中的P