检验前过程步骤对静脉全血基因组DNA质量的影响.pdfVIP

GB/T XXXXX—20XX/ISO XXXXX :20XX 附 录 A （资料性） 检验前过程步骤对静脉全血基因组DNA 质量的影响 A.1 实验操作的一般资料 1） 体外诊断通用检验前工具和程序的标准化和改进（SPIDIA ）是欧洲委员会资助的一个为期四年半 的项目，旨在标准化和改进体外诊断中的检验前程序[19] 。 SPIDIA联盟，为了识别和改进影响静脉全血基因组DNA检验的检验前关键步骤，进行了两个连续的 泛欧洲环试验[16]。总共有197个欧洲实验室和188个欧洲实验室分别参加了比对试验1和比对试验2。来 自单一供体的静脉全血能力验证标本在中心SPIDIA设施上制备，随后在聚丙烯管中被运送到参与的实验 室。此标本用专用的箱子运输，以保持2℃到8℃的恒温范围。 参与者被要求使用他们常规的实验室程序来分离基因组DNA ，并在2℃到8℃的温度下将纯化的 DNA标本送回SPIDIA。为了分析检验前变量对基因组DNA 的影响，分离的基因组DNA标本在SPIDIA 实验室对纯度、产量、高分子量DNA 的完整性和PCR干扰的存在进行了评估。 下文A.2至A.5 的结果展示了重要的发现。 A.2 检验前变量（血液贮存时间、温度、DNA分离方法）对基因组DNA完整性的影响 图A.1展示了参与比对试验1的欧洲实验室采用常规检验前工作流程得到的DNA的完整性。 基因组DNA由参与的实验室按照他们自己的常规程序（血液贮存时间和温度，以及基因组DNA分离方 法）分离得到。采用不同的贮存时间（采血后5-40天）、不同的贮存温度（-20℃、4℃、室温）、不同 的基因组DNA分离方法（基于柱、磁珠、沉淀程序）。通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）评估高分子量DNA [8] 的片段化 。图A.1显示了一组样品（n=25）中的PFGE结果。 图A.1A显示采血后（T ）立即用沉淀法提取的样品中基因组DNA片段大小的分布模式。 0 图A.1B显示参与的实验室提取的样品中基因组DNA片段大小的分布模式。 标引序号说明： A 采血后立即分离的基因组 DNA （参考实验室） 11 GB/T XXXXX—20XX/ISO XXXXX :20XX a到g DNA样品 B 参与比对试验的欧洲实验室分离的基因组DNA 1到84 DNA样品 M 梯度标记物 注1：高分子量 DNA 指大于 50kb 的DNA，见 3.13。 注2：高分子量 DNA 的检验按参考文献[16]的描述进行。 图A.1 血液基因组 DNA 样品的 DNA 片段大小分布 由参与的实验室分离得到的基因组DNA样品显示出不同程度的DNA完整性。基因组DNA的完整性受到 不同实验室内部的检验前过程（血液贮存时间、贮存温度、基因组DNA分离方法）的强烈影响。 这些结果表明，实施标准化的检验前过程有助不同实验室获得更均质的基因组DNA质量。 A.3 基因组DNA的完整性对基于长PCR扩增子检测的影响 基于对检测的T细胞受体（TCR）重组百分比的评估[20][21] ，图A.2显示了DNA完整性对诊断检验结果 的影响。 此检验用于研究免疫系统（如，受癌症、感染、疾病影响的患者）的功能和动力学[20][21] 。此检验 通过多重PCR （含覆盖所有潜在重组的276个PCR反应）分析了TCR重组。PCR扩增的长度在250bp到4500bp 之间。检测的TCR重组的百分比由一个专用特定的软件确定。 [8] 对来自参与实验室的一组基因组DNA样品（n=15）进行检验，以确定其检测TCR重组