检验前步骤对静脉全血血浆中循环游离DNA谱的影响.pdfVIP

GB/T XXXXX—20XX/ISO XXXXX :20XX 附录 A （资料性） 检验前步骤对静脉全血血浆中循环游离DNA 谱的影响 A.1 采血后血液中ccfDNA谱的变化 使用不含ccfDNA谱稳定剂的采血管采集静脉全血，在贮存和运送过程中，血细胞会发生凋亡或机械 裂解，释放出基因组DNA片段，使其脱离细胞变得游离。这些采集后的变化人为地改变了供者体内固有 的ccfDNA谱，可能会导致不可靠或错误的ccfDNA检验结果。通过比较采血后立即获得的血浆样品中的 ccfDNA量与从贮存血液中获得的血浆样品中的ccfDNA量，能检测人为因素导致的采集后ccfDNA释放。 图A.1显示了在含或不含ccfDNA谱稳定剂的情况下，采集后不同贮存时间的静脉全血标本中18S ccfDNA量的变化。 从健康供者 （n = 6）中采集的静脉全血标本收集在不含任何ccfDNA谱稳定剂的EDTA采血管中，不 做任何处理，或在采血后立即通过ccfDNA谱稳定剂进行稳定化处理。血浆获得要么在采血/稳定化 (t0) 后立即获得，要么在室温贮存1、3或6天后。血浆是根据检验提供者的说明从EDTA采血管中获得的。在 室温下进行第一次离心，1900 g离心15分钟。离心后将血浆转移到新管中。在室温下对该血浆进行第二 次离心，1900 g离心10分钟。根据采血管制造商的说明从稳定化后的血液中获得的血浆与从EDTA采血管 的血液中获得的血浆相同。使用自动ccfDNA提取程序从获得的血浆样品中分离ccfDNA。通过实时PCR （66 bp/500 bp扩增子）检测分离的ccfDNA中的18S核糖体DNA （rDNA）拷贝数。 使用不含任何ccfDNA谱稳定剂的EDTA采血管采集和贮存的血液标本显示，室温贮存3天后分离的 ccfDNA中18S rDNA拷贝数显著增加5-10倍，室温贮存6天后可增加20-150倍。 在贮存1天后的血液中也观察到增加。相反，在使用ccfDNA谱稳定剂贮存的血液中没有观察到这些 人为导致的采集后变化。 使用含ccfDNA谱稳定剂的采血管能使细胞中DNA的释放最小化，从而在血液贮存和运送过程中防止 或最小化ccfDNA数量随着时间增加。 使用含ccfDNA谱稳定剂的采血管能避免采集后人为导致的全血中固有ccfDNA谱的变化对检验产生 的影响。 11 GB/T XXXXX—20XX/ISO XXXXX :20XX X 获得血浆之前全血在室温下的贮存时间 （t1：1天，t3：3天，t6：6天） Y 血液贮存指定的时间后获得的血浆中检测到的18S rDNA拷贝数与采血后立即获得的血浆(t0)中18S rDNA拷贝数的比值 1 EDTA血液：不含ccfDNA谱稳定剂 2 稳定化的血液：含ccfDNA谱稳定剂 □18S rDNA基因，66 bp扩增子 ■18S rDNA基因，500bp扩增子 注释1 方框显示上四分位数和下四分位数范围（第25个百分位数到第75个百分位数）。上须线和下须线 显示了单个值的最大值和最小值，每个框内的线显示了每个数据集的中值。 注释2 左图和右图显示了t1和t3的完全相同的结果，并为了视觉清晰调整了Y轴刻度。 图A.1 —静脉全血标本在含或不含ccfDNA谱稳定剂的情况下贮存不同时间后通过实时PCR测定的 18S ccfDNA数量 A.2 ccfDNA谱变化对血浆中表皮生长因子受体突变体检测的影响 图A.2显示了表皮生长因子受体 （EGFR）罕见突变体检测的结果，取决于由含或不含ccfDNA谱稳定 剂的采血管采集的静脉全血在室温下的贮存时间。 使用不含任何ccfDNA谱稳定剂的EDTA采血管或含ccfDNA谱稳定剂的采血管，从健康供者 （n = 7） 中采集静脉全血标本。采血后，立即向所有标本中加入200拷贝的由限制性内切酶处理的包含EGFR外显 子21替代突变（T790M）的参考DNA。获得的血浆如A.1所述。血浆要么在采血后立