实训 ATP的提取分离.docxVIP

实训ATP的提取别离［任务描述］ 三磷酸腺甘是体内广泛存在的辅酶，是体内组织细胞所需能量的主要来源， 蛋白质、脂肪、糖和核甘酸的合成都需ATP参与。ATP经腺昔酸环化酶催化形 成环磷酸腺昔(cAMP),是细胞内的生物活性物质，对细胞许多代谢过程有重要 的调节作用。 ATP为蛋白质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量，促使肝细胞修复和 再生，增强肝细胞代谢活性，对治疗肝病有较大针对性。ATP为白色类白色粉末, 易溶于水，难溶于有机溶剂。在水中的溶解度具有氢型〉钠盐〉领盐〉汞盐的顺 序。在碱性溶液(pHlO.O)及低温下比拟稳定。ATP二钠是两性化合物。能与可溶 性汞盐和领盐形成不溶于水的沉淀物，利用这种性质可别离ATP。本次实训任务 采取兔肌肉为材料，提取别离ATP。 ［任务实施］ 一、准备工作 .建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录 到工作表。 .收集以兔肌肉为材料，提取别离ATP工作中必须信息，掌握相关知识及 操作要点，与指导教师共同确定出一种最正确的工作方案。 .完(2)试剂 冷蒸储水、0.03mol/L及lmol/L氯化钠溶液、95%的乙醇、 硅藻土、活性炭、成任务单中实际操作前的各项准备工作。 (1)材料准备兔肌肉 无水乙醇、乙醛、6mol/L盐酸、717强碱型阴离子交换树脂(氯型)、DEAE-C 薄板。 (3)仪器4号垂熔漏斗、玻璃棒、量筒、色谱柱、五氧化二磷干燥器、 布氏漏斗。 二、操作过程(一)操作流程见图lo (二)操作过程 .兔肉松的制备 将无骨的兔肌肉冷冻后剁细于捣碎机中破碎3min成兔肉糜，加等体积95%的冷乙醇，搅拌均匀后，静置30min,迅速升温至100℃,煮沸5min,迅速冷却 至20?25℃,用尼龙布过滤，留取肉饼，剁碎后于10℃以下冷风吹干，得兔肉松 备用。 ［肉糜制备］ 兔肉 ［肉糜制备］ 兔肉 ? 兔肉糜 绞碎、冰浴、降温1 ［原料处理］ ? 变性兔肉糜 95%冷乙醇，30min ［捣碎、吹干］10℃以下兔肉饼＜图 ［捣碎、吹干］ 10℃以下 兔肉饼＜ 图1 ATP提取操作流程 .提取 取肉松加入4倍量冷蒸储水，搅拌提取30min,过滤后再提取1次。合并2 次滤液，冷处静置3h,经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液。 .装柱、上样 取处理好的氯型阴离子交换树脂装入色谱柱，用pH3的水将柱平衡。提取 液上柱流速控制在0.6?lmL/(cm2.min)左右，吸附ATP。上柱过程中用DEAE-C 薄板检查有核昔酸流出为止。 .洗脱、收集 用pH3, 0.03mol/L氯化钠溶液洗涤柱上滞留的AMP、ADP及无机盐等，流 速控制在lmL/(cm2.min),用DEAE-C薄板检查无核甘酸流出为止。再用pH3.8, lmol/L氯化钠溶液洗脱ATP,操作温度在0~10℃,流速控制在0.3mL/(cm2.min), 收集洗脱液，用DEAE-C薄板检查无核甘酸流出为止。 .除热原、杂质 将洗脱液按总体积计加入0.6%的硅藻土、0.4%的活性炭，搅拌lOmin,用 4号垂熔漏斗过滤，收集ATP滤液。 .结晶、干燥 用6moi/L盐酸调滤液至pH2.5?3.0,在28℃的水浴中恒温，加乙醇，不断 搅拌，使ATP二钠结晶，用4号垂熔漏斗过滤，分别用无水乙醇、乙酸洗涤， 收集ATP二钠结晶，置五氧化二磷干燥器内真空干燥，即得ATP成品。 三、结束工作 .填好所有操作记录、任务单、各种评价表。 .检查设备仪表是否洁净完好。 .检查工作场地及环境卫生。 .进行任务总结。 ［工作反思］ 1.提取ATP时，哪些措施可以防止三磷酸腺甘酶（ATP酶）的作用？