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茶叶中儿茶素类的检测——HPLC法 仪器及用具 分析天平:感量0.0001g。 水浴:70℃±1 ℃。 离心机:转速3500r/min。 混匀器。 高效液相色谱仪(HPLC):包含梯度洗脱及检测器(检测波长278nm)。 数据处理系统。 液相色谱柱:C18(粒径5μm,250mm*4.6mm)。 第六十二页,共一百零二页。 试剂 所用水均为重蒸馏水,除特殊规定外,所用试剂为分析纯。 乙腈:色谱纯。 甲醇。 乙酸。 甲醇水溶液(体积比):7+3. 乙二胺四乙酸(EDTA)溶液:10mg/mL(现配)。 抗坏血酸溶液:10mg/mL(现配)。 第六十三页,共一百零二页。 稳定溶液:分别将25mLEDTA溶液、25mL抗坏血酸溶液、50mL乙腈加入500mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。 液相色谱流动相: 流动相A:分别将90mL乙腈、20mL乙酸、2mLEDTA加入1000mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。溶液需过0.45μm膜。 流动相B:分别将800mL乙腈、20mL乙酸、2mLEDTA加入1000mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。溶液需过0.45μm膜。 第六十四页,共一百零二页。 标准储备溶液: 咖啡碱储备溶液:2.00mg/mL。 没食子酸(GA)储备溶液: 0.100mg/mL。 儿茶素类储备溶液:+C1.00mg/mL,+EC1.00mg/mL,+EGC2.00mg/mL,+EGCG2.00mg/mL,+ECG2.00mg/mL。 标准工作溶液:用稳定溶液配制。 标准工作溶液的浓度:没食子酸5μg/mL~25μg/mL、咖啡碱50μg/mL~150μg/mL、+C50μg/mL~150μg/mL、+EC50μg/mL~150μg/mL、+EGC100μg/mL~300μg/mL、+EGCG100μg/mL~400μg/mL、+ECG50μg/mL~200μg/mL。 第六十五页,共一百零二页。 操作方法 取样:按GB/T 8302的规定。 试样制备:按GB/T 8303的规定。 测定: 干物质含量测定:按GB/T 8303的规定。 第六十六页,共一百零二页。 供试液的制备: 母液:称取0.2g(精确到0.0001g)均匀磨碎的试样于10mL离心管中,加入在70℃中预热过的70%甲醇溶液5mL,用玻璃棒充分搅拌均匀润湿,立即移入70℃水浴中,浸提10min(隔5min搅拌一次),浸提后冷却至室温,转入离心机在3500r/min转速下离心10min,将上清液转移至10mL容量瓶。残渣再用5mL的70%甲醇溶液提取一次,重复以上操作。合并提取液定容至10mL,摇匀,过0.45μm膜,待用(该提取液在4 ℃下可至多保存24h )。 测试液:用移液管移取母液2mL至10mL容量瓶中,用稳定溶液定容至刻度,摇匀,过0.45μm膜,待测。 第六十七页,共一百零二页。 色谱条件 流动相流速:1mL/min。柱温:35 ℃。紫外检测器:波长278nm。 梯度条件:100%A相保持10min 15min内由100%A相→68%A相、32%B相 68%A相、32%B相保持10min 100%A相 第六十八页,共一百零二页。 测定待流速和柱温稳定后,进行空白运行。准确吸取10μL混合标准系列工作液注射入HPLC。在相同的色谱条件下注射10μL测试液。测试液以峰面积定量。 第六十九页,共一百零二页。 结果计算 计算方法:以儿茶素类标准物质定量: 式中: A—所测样品中被测成分的峰面积; fStd—所测成分的校正因子(浓度/峰面积,浓度单位μg/mL); V—样品提取液的体积。单位为毫升(mL); d—稀释因子(通常为2mL稀释成10mL,则其稀释因子为5); m1—样品称取量,单位为克(g); m—样品的干物质含量,%。 第七十页,共一百零二页。 计算方法:以咖啡碱标准物质定量 式中: RRfStd—所测成分相对与咖啡碱的校正因子; SCaf—咖啡碱标准曲线的斜率(峰面积/浓度,浓度单位μg/mL )。 儿茶素类相对咖啡碱的校正因子表 名称 GA +EGC +C +EC +EGCG +ECG RRfStd 0.84 11.24 3.58 3.67 1.72
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