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茶叶中儿茶素类的检测——HPLC法 仪器及用具 分析天平：感量0.0001g。 水浴：70℃±1 ℃。 离心机：转速3500r/min。 混匀器。 高效液相色谱仪（HPLC）：包含梯度洗脱及检测器（检测波长278nm）。 数据处理系统。 液相色谱柱：C18（粒径5μm，250mm*4.6mm）。 第六十二页，共一百零二页。 试剂 所用水均为重蒸馏水，除特殊规定外，所用试剂为分析纯。 乙腈：色谱纯。 甲醇。 乙酸。 甲醇水溶液（体积比）：7+3. 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液：10mg/mL（现配）。 抗坏血酸溶液：10mg/mL（现配）。 第六十三页，共一百零二页。 稳定溶液：分别将25mLEDTA溶液、25mL抗坏血酸溶液、50mL乙腈加入500mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。 液相色谱流动相： 流动相A：分别将90mL乙腈、20mL乙酸、2mLEDTA加入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。溶液需过0.45μm膜。 流动相B：分别将800mL乙腈、20mL乙酸、2mLEDTA加入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。溶液需过0.45μm膜。 第六十四页，共一百零二页。 标准储备溶液： 咖啡碱储备溶液：2.00mg/mL。 没食子酸（GA）储备溶液： 0.100mg/mL。 儿茶素类储备溶液：+C1.00mg/mL，+EC1.00mg/mL，+EGC2.00mg/mL，+EGCG2.00mg/mL，+ECG2.00mg/mL。 标准工作溶液：用稳定溶液配制。 标准工作溶液的浓度：没食子酸5μg/mL~25μg/mL、咖啡碱50μg/mL~150μg/mL、+C50μg/mL~150μg/mL、+EC50μg/mL~150μg/mL、+EGC100μg/mL~300μg/mL、+EGCG100μg/mL~400μg/mL、+ECG50μg/mL~200μg/mL。 第六十五页，共一百零二页。 操作方法 取样：按GB/T 8302的规定。 试样制备：按GB/T 8303的规定。 测定： 干物质含量测定：按GB/T 8303的规定。 第六十六页，共一百零二页。 供试液的制备： 母液：称取0.2g（精确到0.0001g）均匀磨碎的试样于10mL离心管中，加入在70℃中预热过的70%甲醇溶液5mL，用玻璃棒充分搅拌均匀润湿，立即移入70℃水浴中，浸提10min（隔5min搅拌一次），浸提后冷却至室温，转入离心机在3500r/min转速下离心10min，将上清液转移至10mL容量瓶。残渣再用5mL的70%甲醇溶液提取一次，重复以上操作。合并提取液定容至10mL，摇匀，过0.45μm膜，待用（该提取液在4 ℃下可至多保存24h ）。 测试液：用移液管移取母液2mL至10mL容量瓶中，用稳定溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm膜，待测。 第六十七页，共一百零二页。 色谱条件 流动相流速：1mL/min。柱温：35 ℃。紫外检测器：波长278nm。 梯度条件：100%A相保持10min 15min内由100%A相→68%A相、32%B相 68%A相、32%B相保持10min 100%A相 第六十八页，共一百零二页。 测定待流速和柱温稳定后，进行空白运行。准确吸取10μL混合标准系列工作液注射入HPLC。在相同的色谱条件下注射10μL测试液。测试液以峰面积定量。 第六十九页，共一百零二页。 结果计算 计算方法：以儿茶素类标准物质定量： 式中： A—所测样品中被测成分的峰面积； fStd—所测成分的校正因子（浓度/峰面积，浓度单位μg/mL）； V—样品提取液的体积。单位为毫升（mL）； d—稀释因子（通常为2mL稀释成10mL，则其稀释因子为5）； m1—样品称取量，单位为克（g）； m—样品的干物质含量，%。 第七十页，共一百零二页。 计算方法：以咖啡碱标准物质定量 式中： RRfStd—所测成分相对与咖啡碱的校正因子； SCaf—咖啡碱标准曲线的斜率（峰面积/浓度，浓度单位μg/mL ）。 儿茶素类相对咖啡碱的校正因子表 名称 GA +EGC +C +EC +EGCG +ECG RRfStd 0.84 11.24 3.58 3.67 1.72