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物体表面细菌总数 物体表面细菌总数 方法：将内径为5cm×5cm的灭菌规格板，放在被检物件体表面，根据物体表面积大小，采平行样l～4个，用浸有灭菌生理盐水的棉拭子，在规格板内涂抹10次（往返计为1次），将棉拭子放入l0ml灭菌生理盐水的采样管中。 物体表面细菌总数 将每个采样管震打80次，混匀，10倍递减稀释，每个稀释度（取3个稀释度）分别取1ml放于灭菌培养皿（每个稀释度倾注2块平板），用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养24h,观察结果，取菌落数为30～300的培养皿计算，求出平均菌落数。 菌数（cfu）/cm2= 平均菌数×稀释倍数/采样面积（cm2） 无菌实验 无菌实验预防假阳性措施 1在一个专门准备、环境控制的房间内的层流罩的环境中进行测试 2在整个测试过程中使用无菌技术 3用避免污染的方法把测试器皿、培养基和测试物品引入测试区 4测试产品表面的细菌污染，在引导测试物品进入测试区之前，先对产品的外包装进行消毒。 5对测试中使用的设备、材料和产品进行灭菌 6简化进行测试必须的操作 7尽量避免悬浮微粒的产生 8环境时时监测（沉降菌检测） 无菌实验相关标准 医用器材的灭菌 微生物学方法 第二部分：确认灭菌过程的无菌试验 ISO 11737-2 2009-医用器材的灭菌 微生物学方法 第二部分：确认灭菌过程的无菌试验 无菌实验：培养条件 不论哪种无菌试验方法：FTM32.5±2.5℃，不少于14天；SCDB22.5±2.5℃，不少于14天； 改良马丁23-28℃，不少于14天。 如果14以内观察到阳性结果，不必继续培养。 无菌实验阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品．以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗霉菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。加菌量小于l00cfu，供试品用量同供试品无菌实验时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好． 阴性对照 阴性对照：阴性对照供试品无菌实验时，应取相应溶剂和稀释同法操作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 无菌实验：结果判断 肉汤培养基有菌生长的常见三种形式： 混浊生长：液体变混浊。 菌膜：液体澄清，表面有一薄层菌膜。 沉淀生长：液体澄清，管底有沉淀物 混浊生长：液体变混浊 肉汤培养基有菌生长的常见形式 无菌实验：结果判断 1.阳性对照管应生长良好，阴性对照管应无菌生长 2.培养期间逐日观察并记录是否有菌生长，如培养14天后，培养基出现浑浊，但不能确定是否有微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基或划线接种于斜面培养基上，细菌培养两天，霉菌培养三天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。 释出物检查 无菌实验验证：释出物检查 目的：对未知或可疑的供试品，在进行无菌试验实验前进行方法验证试验，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。 无菌实验验证：释出物检查 取灭菌产品以无菌操作转移到培养基中,30-35℃培养24hrs ； 注意：使用与实际无菌实验同种等量的培养基 接种每毫升浓度小于100cfu的菌种稀释液在无菌培养基内，一式两份，其中一份加入无菌试样，另一份作为阳性对照，并在合适的温度培养不超过5天。按表1所列菌种重复以上步骤。 无菌样品 100cfu 菌种 ＋ 无菌样品 实验组 对照组 释 出 物 检 查 在合适的温度培养不超过5天。选择合适的微生物，重复以上步骤。 释出物检查 解释：通过与阳性对照对比，如果在培养容器内看不到微生物生长，则说明使用的样品能抑止细菌或霉菌的生长。可以考虑使用无菌中和剂，如吐温80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、β-内酰胺酶。如果中和剂无效，增加培养基的量。尽量使用能使试验微生物生长的最小的培养基的量。 释出物检查常用菌种 初始污染菌 定 义 生物负载 ：一件产品和/ 或包装上存活的微生物总数。 生物负载估计值 ：通过对活菌计数或灭菌前活菌计数加上一个回收效率补偿系数， 得出的组成生物负载的微生物数值 。 初始污染菌相关标准 医用器材的灭菌 微生物学方法 第一部分产品上微生物总数的估计 医用器材的灭菌 微生物学方法 第一部分产品上微生物总数的估计 样品份额取样原则 1 定义：样品份额 (SIP) sample item portion，即从某一保健产品单元上取出的用于试验的部分。 2取样注意事项 若可操作，试验应使用整个产品单元。但这往往被认为是不可行的，产品单元上的样品份额宜在实验室易于操作的前提下尽可能大。 如果所用的样品份额( (SIP) 小于一个完整的产品单元，则应