- 1、本文档共5页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
模块九 激光共聚焦技术
1.实验目的
让学生了解激光共聚焦显微镜硬件组成,掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项,
能够熟练、准确地设计光路,重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法以及钙
2+
指示剂(fluo-3/AM)标记Ca 的基本原理与方法,了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。
2. 实验原理
激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源,在传统荧光显微镜成像的基础上,附加了激光扫描
装置和共轭聚焦装置,通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。激光扫描共聚焦显微
镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
激光扫描共聚焦显微镜基本结构
(1)扫描模块
扫描模块主要由针孔光栏(控制光学切片的厚度)、分光镜(按波长改变光线传播方向)、发射
荧光分色器(选择一定波长范围的光进行检测)、检测器(光电倍增管)组成。
荧光样品中的混合荧光进入扫描器,经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后,被分成各单
色荧光,分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象,同时在计算机屏幕上可以显示几
个并列的单色荧光图象及其合成图象。
(2)荧光显微镜系统
激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同,但又有其特点:需与扫
描器连接,使激光能进入显微镜物镜照射样品,并使样品发射的荧光到达检测器;需有光路转换装
置,即汞灯与激光转换,同时汞灯光线强度可调。
(3)常用激光器
激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统,常用的激光器包括以下三种类
型:
多谱线 Ar 离子激光器(氩离子激光器):发射波长为458 nm、477 nm、488 nm、514 nm 的蓝绿
光;He-Ne 激光器(氦氖激光器):发射波长为543 nm 的绿光和 633 nm 的红光;UV 激光器(紫外
激光器):发射波长为351 nm、364 nm 的紫外光。
(4)辅助设备
风冷、水冷冷却系统及稳压电源。
激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理:激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光
器发射的一定波长的激发光,光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源,由物镜聚焦
于样品的焦平面上,样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光,通过检测孔光栏后,到达检测
器,并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦
图像,称为光切片。
1
检测器
发射滤片
检测针孔光径 光线放大
检测分光镜 照明针孔光栏 激光器
物镜
z
x
样品 背景 焦平面
激光聚焦点 F
激光共聚焦显微镜工作原理示意图
3. 实验仪器
激光共聚焦显微镜
4. 实验试剂
百合花粉萌发液体培养基:1.27 mM CaCl ;0.162 mM H BO ;0.99 mM KNO ;10% 蔗糖。
2 3 3 3
fluo-3/AM 荧光探针(DMSO 配制,贮存液浓度 1000 M )。
5. 实验步骤
(1)激光共聚焦显微镜获得图象基本操作:
启动激光共聚焦显微镜、软件和激光器;在 VIS 模式中观察样品;转入LSM 配置;扫描图像;
数据存储
(2)激光共聚焦显微镜具体操作步骤:
开机步骤:接通系统总开关。显微镜、汞灯电源、温度控制器、除 UV 以外的激光器,平时可
文档评论(0)