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第1页/共71页第2页/共71页第3页/共71页第4页/共71页第5页/共71页第6页/共71页第三节PB与PBE一、PB（polybuffer）-多组分缓冲液为分子量不同的多羧基多氨基化合物（两性电解质性缓冲剂）特点：⑴.I不高，但缓冲力强； ⑵.缓冲能力是均匀的。第7页/共71页二、PBE(polybuffer exchange) ——多缓冲交换剂以交联琼脂糖Sepharose CL-6B为基质，并在糖上通过醚键偶合上配基而成 如低聚乙烯亚胺要求： 确保很宽的pH范围有均衡的缓冲容量。第8页/共71页第四节 实验要点步骤样品pI的查阅或测定选PBE，PB和起始缓冲液装柱，平衡安装仪器（增pH计）加PB少量入柱第9页/共71页加样加PB洗脱 再生PBE洗脱液 脱PB一、PBE，PB和起始缓冲液的选择⑴. 查pI或测定⑵. 由pI确定pH梯度范围 最大范围 3～3.5第10页/共71页为提高Rs,选择的pH范围应含要分离样品pI，并使其有2/3～1/2的柱长的吸附解吸时间。㈢.由产品性能表选择⑴. PBE94⑵.选始缓冲液pH9.4，乙醇胺-HAC （0.025） ⑶.选PB96 用HCl调pH7.0第11页/共71页二、装柱㈠.PBE量由样品量确定PBE量一般100mgpr/10ml床体积、每pH单位 ㈡.柱选择H/D=30～60㈢.充填（同前）㈣.平衡 用始缓平衡，要求：⑴.缓冲液使用前应先脱气，以除去其中CO2⑵.需平衡到进出液pH、I、电导都一样。㈤.校验 柱装好坏，用有色的牛细胞色素C检查。第12页/共71页三、样品㈠.VS因聚焦浓缩效应，VS最大可达50%～2Vt但最好≤0.5Vt㈡.I＜0.05㈢.加样要求：⑴.上样前应先加5mlPB，以免…… ⑵.需使样品均匀平整加在床面上第13页/共71页 四 、洗脱㈠.洗脱剂用量 pH取决于洗脱剂浓度 梯度 浓度大，峰间距小 范围 浓度小，峰宽大… 梯度体积 一般：12～13Vt第14页/共71页㈡.流速一般线速在30～40cm/hr㈢.检测主要是目的物浓度、pH五、PB的除去1.沉淀法：加硫铵，再透析 2.凝胶过滤：常用Sephadex G-75第15页/共71页 六、再生 一般：①.先除去吸附的杂质 对pI＜6，在柱顶，可用1mol/LNaCl 对pI很小，可用0.1mol/LHCl ②.用起始缓冲液平衡七、保存 24%乙醇第16页/共71页八、结果讨论㈠.顶替（取代）效应 带电量除与pI有关，还与滴定曲线有关，B在pH更高才被吸附（如下图所示）+pHII静电荷pHpH-AB洗脱V第17页/共71页 后期I的增加 出现竞争性结合 影响B类分子的吸附 造成B类分子提前洗脱㈡.陶南效应（阴IE）因表观pI下降，出现滞后洗脱。㈢.溶解度造成滞后洗脱因pH pI时S ，往往需更低pH时， 其S ，才被洗出。第18页/共71页第五节 技术的应用蛋白质类（包括酶）的分离蛋白质类（包括酶）等电点测定P175-177第19页/共71页第七章 亲和色谱 Affinity Chromatography, AC 第一节 概述原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。一、特点高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性第20页/共71页 二、应用高效从复杂混合物中得某一种物质；基于生物功能可把有活性与无活性分开三、基本过程 须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）第21页/共71页第22页/共71页 亲和层析法的作用原理示意第23页/共71页说明：1.偶联用Gel（须是活化偶联介质）2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和吸附剂3.按相互作用力划分：次级键——亲和色谱配位键——螯合色谱共价键——共价色谱疏水键——疏水色谱第24页/共71页亲和层析的必要条件: 合适的配体（配基、ligand) 合适的载体（Matrix) 合适的吸附和洗脱条件第25页/共71页第二节 亲和色谱配基 (ligand L)㈠ 作为配体的条件 亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活㈡常用系统酶:底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物核酸:互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物激素:受体、运载蛋白抗体:抗原、病毒、细胞外源凝集素:多糖、糖蛋白、细胞第26页/共71页㈢ 配体的浓度 一般使用较高的固定化配体浓度 配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低 配体浓度过高引起色谱畸变。(与很多物质发生非特异性结合)第27页/共71页 ㈣ 配体的选择 1.?考虑亲和势L + S LSKl= [L][S]/[LS]要求Kl在10-4～10-8mol/L之间 2.??与L的偶联不破坏L与S的结合 3.??需了解L-S