核酸含量测定.pptxVIP

第1页/共25页实验目的1 学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量与纯度的原理与技术；2 熟悉核酸定量分析仪的基本原理与使用。第2页/共25页核酸定量分析仪——DNA/RNA计算器型号：GeneQuant pro 品牌：通用（GE）产地：美国波长校准：启动后自动进行 波长范围：230, 260, 280, 320,546,562, 595,600nm 第3页/共25页用 途（1）核酸和引物样品扫描测定；（2）可检测低至20ng 的核酸样品（用7微升超微量比色杯），显示A260/280和A260/230比值作为核酸纯度检测的指标 ；（3）可采用在 595nm 的Bradford 法、546nm 的双缩脲法和562nm 的BCA 法进行蛋白检测，样品通过存贮的标准曲线进行测量，直线的线性回归结果可打印出来；（4）OD600 细菌细胞培养测定；（5）计算寡核苷酸分子量，理论Tm值（用于PCR退火温度）。第4页/共25页546nm——双缩脲法/lowry法（Folin-酚法 ）双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成蓝紫色复合物，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。 lowry法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。 562nm——BCA法在碱性条件下，蛋白质将Cu2+ 还原为Cu+ ,Cu+ 与BCA 试剂形成紫色络合物，其吸光值与蛋白浓度成正比。595nm——考马斯亮兰法（Bradford法 ）考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比。第5页/共25页OD600 ——检测细菌培养液的浓度利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以通常用来指菌体细胞密度。测量细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值如果在之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD6003表明细菌已经饱和。细菌的生长情况,可以通过测OD600来监测。细菌的生长比较好的时期是在OD600为1时，此时可以进行传代等研究。 第6页/共25页第7页/共25页比色杯第8页/共25页第9页/共25页第10页/共25页参数设定DNASet-upSelect 修改参数Enter确认第11页/共25页设定空白将空白溶液加入比色杯中Set ref第12页/共25页核酸含量和纯度测定将待测核酸样品按照比例稀释后，加入比色杯中DNA 或 enter第13页/共25页实验原理 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C-C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。 核酸（DNA、RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以利用紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。第14页/共25页Lambert-Beer 定律 ——光吸收基本定律　 当一束平行的单色光通过溶液时，溶液的吸光度 (A) 与溶液的浓度 (C) 和厚度 (b) 的乘积成正比。它是分光光度法定量分析的依据。 第15页/共25页实验原理在不同pH 溶液中，嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质含量时均应在固定的pH溶液中进行。第16页/共25页碱基的互变异构嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互变异构现象，一般生理pH条件下呈酮式。互变异构会使碱基间发生错配，使A-C、T-G等 。当胸腺嘧啶以正常形式（即酮基型）为模板时，配对的互补碱基为腺嘌呤；当前者变为烯醇型结构时，通过氢键配对的碱基可变为鸟嘌呤。第17页/共25页实验原理采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm 波长下，10mm光径的比色杯中，光密度为的DNA或RNA溶液的浓度为50或40μg/ml 。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液在OD260nm的吸光度值，即可计算测出其中核酸的含量。第18页/共25页DNA浓度计算 DNA浓度（μg/mL）＝系数×Abs260系数=光径×稀释倍数第19页/共25页实验原理OD230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、苯酚等，Tris，EDTA和其他缓冲液的盐在这个波长都有吸收；OD320 表示检测溶液的混浊度和其他干扰因子，纯样品OD320一般是0，若溶液盐浓度越高，OD320的数值也越高。第20页