乙肝两对半定性测定PPT课件.ppt

.专业医学讨论. .护理诊疗 乙肝两对半测定 －酶联免疫法 实习生：廖於波 指导老师：李海龙 * HBV是乙型病毒性肝炎的病原体。HBV感染呈世界性流行，但不同地区感染的流行程度差异很大。据WHO报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。我国属高流行地区一般地区HBsAg阳性率为7.18%。 * 乙肝病毒血清标志物 HBsAg 第一个出现，感染后1-2周即可阳性 阳性表示存在HBV感染 HBsAb 出现在HBsAg消失后 保护性抗体 疫苗免疫成功的标志 * 乙肝病毒血清标志物 HBeAg 病毒复制标志 传染性强 HBeAb 传染性降低 长期存在是DNA与肝细胞整合的结果 * 乙肝病毒血清标志物 HBcAg HBV复制的标志 血清中难以检测出来 IgM-HBcAb 急性HBV感染 IgG-HBcAb 急性感染恢复期和慢性持续感染 * 检测HBV病毒血清标志物是临床最常用的病原学诊断方法。HBV具有三个抗原抗体系统，即乙肝表面抗原（HBSAg）和乙肝表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗体（HBeAb）、核心抗原（HBcAg）核心抗体（HBcAb），由于HBcAg在血液中难于检出，故临床免疫学检测不包括HBcAg，目前常采用酶联免疫法和化学发光法检测。 * 酶联免疫吸附实验原理 用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。 * 乙肝病毒血清标志物检测原理 血清学标志 原理 包被试剂 标记或结合物 结果判断 HBsAg 夹心法 HBsAb HBsAb 显色(+) HBsAb 夹心法 HBsAg HBsAg 显色(+) HBeAg 夹心法 HBeAb HBeAb 显色(+) HBeAb 竞争法 HBeAb HBeAb及中和抗原 不显色(+) HBcAb 竞争法 HBcAg HBcAb 不显色(+) * 标本本要求 采集： 血浆：使用抗凝血浆管（枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一为抗凝剂）采集样品。样品离心分离后，提取血浆用于检测。 血清：采用正确医用技术采集标本。离心分离后，提取血清样品用于检测。 * 标本要求 储存：样品可存放于2~8℃冰箱，24小时内测定。若需长时间保存，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。上述样品使用前应恢复到室温，轻轻摇动混匀。若标本有沉淀物形成，应离心除去，并确定未变质方可使用。严重融血或脂血标本不可使用。 * 试剂（安图生物） 编号 组分名称 96人份 1 包被板 69孔X1块 2 样品稀释液 2.3ml X1瓶 3 酶结合物 5.5ml X1瓶 4 底物液 6.2ml X1瓶 5 显色剂 6.2ml X1瓶 6 洗涤液 30ml X1瓶 7 终止液 5.5ml X1瓶 8 阴性对照 1.0ml X1瓶 9 阳性对照 1.0ml X1瓶 10 子母袋 1个 11 说明书 1份 12 板贴 3张 主要组成成分 * 实验前准备 1.取出试剂盒及待测样品，将所有试剂及样品恢复至室温（18~25℃）。 2.将恒温箱或水浴锅调至反应温度。 3.洗液用蒸馏水作20倍稀释后备用。 * 检验步骤 排板 * 检验步骤 表面抗原（两步法） 1.留一孔作空白对照，加入样本稀释液20ul/孔（含空白孔），其他加入阴性对照三孔和阳性对照二孔100ul/孔及待测标本100ul/孔于相应的反应孔内。 2.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。 3.贴上板贴，置37℃下温育60分钟。 * 检验步骤 4.撕下板贴，除空白孔外，各孔加入酶结合物50ul。 5.在微型振荡器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。 6.贴上板贴，置37℃下温育30分钟。 7.撕下板贴，洗板6次，最后在吸水纸上拍干。 8.每孔加入底物液、显色剂各50ul，37℃避光温育30分钟。 * 检验步骤 9.加终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀后，立即测试结果。 10.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。 * 检验步骤 表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体（一步法） 1.留一孔空白，三孔加入阴性对照、二孔加入阳性对照各50ul/孔，其他各孔分别加入样本50ul (HBcAb测定时待测血清用生理盐水1:30稀释－50ul血清+1.5ml生理盐水) 。 2.除空白孔外，各孔加入酶结合物50ul。 3.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。 4.贴上