FoxA3和Hnj4a对原代大鼠肝细胞体外增殖的促进效应（农学毕业论文资料）.docVIP

FoxA3和Hnj4a对原代大鼠肝细胞体外增殖的促进效应（农学毕业论文资料） 文档信息 ： 文档作为关于“医学心理学”中“肿瘤学”的参考范文，为解决如何写好实用应用文、正确编写文案格式、内容素材摘取等相关工作提供支持。正文7942字，doc格式，可编辑。质优实惠，欢迎下载！ 正文 FoxA3和Hnj4a对原代大鼠肝细胞体外增殖的促进效应（农学毕业论文资料） 文1：FoxA3和Hnj4a对原代大鼠肝细胞体外增殖的促进效应 ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０７．０３０ 肝细胞占总肝量的７０％～８０％，具有合成血清蛋白、酶和辅酶因子，储存糖原和维生素，以及参与药物和外源物质代谢等功能，是肝脏生理功能的主要执行者［１］。在体外，肝细胞可广泛应用于基础研究、药物研发、生物人工肝及细胞治疗的研究与临床中［２］。因此对功能完善的肝细胞有较高的需求，尽管原代肝细胞具有较完整的肝细胞功能，但体外培养中难以增殖和长期维持肝细胞的功能［３］。提高肝细胞体外增殖能力是解决肝细胞来源匮乏的一个重要方向，目前实现肝细胞体外增殖的策略有：①在培养基中添加生长因子、激素或化学物质［３－５］；②使用特殊的基质或者肝细胞和其他细胞共培养［６－９］； ③肝细胞转染外源基因实现永生化［１０］。前两种策略能较好地维持肝细胞的特异基因表达和功能，但细胞体外增殖能力有限；肝细胞永生化能使体外培养的肝细胞获得无限增殖的能力，主要策略有猴肾病毒４０大Ｔ抗原（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ，ＳＶ４０Ｔ）［１１］和端粒酶逆转录酶（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＴＥＲＴ）［１２］基因介导的永生化。 ２０１１年Ｓｅｋｉｙａ等［１３］将肝细胞核因子组合Ｆｏｘａ３和Ｈｎｆ４α导入小鼠成纤维细胞中，获得具有体外增殖能力的肝样细胞，这表明ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α可能对肝细胞体外增殖有促进作用。因此本研究旨在探讨ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α是否能促进体外培养的原代大鼠肝细胞增殖，以期建立一种基于肝细胞特异基因作用的永生化肝细胞系，为肝细胞永生化提供新思路。 １ 材料与方法 １．１ 细胞株、试验动物和主要试剂 人ＨＥＫ２９３Ｔ细胞、ＨＥＫ２９３细胞、慢病毒载体ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰ（以下简称ｐＣＤＨ） 质粒、包装质粒ｐＣＭＶΔ８．９１和ｐＶＳＶ－Ｇ均为本实验室保存；ｐＵＣ５７－ＦｏｘＡ３和ｐＵＣ５７－Ｈｎｆ４α质粒及所有引物均合成于生工生物工程有限公司；ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、质粒小量提取试剂盒ＴａＫａＲａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＤＮＡ切胶回收试剂盒ＴａＫａＲａ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．０、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ均购自宝生物工程（大连）有限公司；ＥＧＴＡ、ＣａＣｌ２、ＢＥＳ、Ｔｒｉｚｏｌ均购自上海鼎国生物工程有限公司；Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠由河南师范大学动物中心提供，原代大鼠肝细胞从ＳＤ大鼠肝脏中分离；胶原酶、肝细胞培养添加剂Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｓｅｌｅｎｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＴＳ－Ｇ）１００×、ＤＭＥＭ（高糖）培养基和胎牛血清均购自Ｇｉｂｃｏ公司；血液／细胞／组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒购自ＴＩＡＮＧＥＮ公司；Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；糖原ＰＡＳ过碘酸雪夫染色试剂盒和吲哚菁绿分别购自森贝伽公司和ａｌａｄｄｉｎ公司。 １．２ 载体构建与鉴定 根据大鼠ＦｏｘＡ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ：），-Ｈｎｆ４α（Ｇｅｎｅ ＩＤ：，ＮＭ ０２２１８０．２）基因序列，使用Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０设计包含ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点（加粗）的ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α引物。引物序列为：ＦｏｘＡ３上游引物：５′－ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＴＧ－３′；ＦｏｘＡ３下游引物：５′－ＧＧＣＣＴＴＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＴＡＡＣ－３′；Ｈｎｆ４α上游引物：５′－ＴＧＣＴＣＴＡ－ＧＡＡＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣ－３′；Ｈｎｆ４α下游引物：５′－ＧＧＣＣＴＴＡＡＧＧＧＡＴＣＴＡＣＣＧＡＡＧＧ－３′。分别以ｐＵＣ５７－ＦｏｘＡ３和ｐＵＣ５７－Ｈｎｆ４α为模板，ＰＣＲ扩增ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α，ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ＰＣＲ产物，酶切后的目的片段分别插入ｐＣＤＨ质粒中，连接产物转入ＤＨ５α感受态大肠杆菌，对长出的克隆进行双酶切鉴定。 １．３ 细胞培养 人ＨＥＫ２９３细胞和ＨＥＫ２９３Ｔ细胞培养在ＤＭＥＭ高糖培养基中，内