海南与越南缅甸蟒线粒体控制区遗传多样性及差异性分析（农学毕业论文资料）.docVIP

海南与越南缅甸蟒线粒体控制区遗传多样性及差异性分析（农学毕业论文资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：海南与越南缅甸蟒线粒体控制区遗传多样性及差异性分析 1 文2：德化黑鸡线粒体DNA控制区全序列测定及起源研究 7 1 材料与方法 8 2 结果与分析 9 3 结论与讨论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 海南与越南缅甸蟒线粒体控制区遗传多样性及差异性分析（农学毕业论文资料） 文1：海南与越南缅甸蟒线粒体控制区遗传多样性及差异性分析 DOI:/-.035 缅甸蟒（Ｐｙｔｈｏｎ ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ）主要分布于东南亚国家和中国海南、云南、广东、广西、福建、四川等地［１］，是国家一级保护动物，被列于《濒危动植物种国际贸易公约》（ＣＩＴＥＳ）附录ＩＩ。缅甸蟒用途广泛，蟒皮可用来制作民族乐器、高档皮具，据统计，２０００-２０１０年缅甸蟒皮的出口量仅在越南就已达到年平均１０万张［２］；蟒油具有疏通经脉、消肿抑菌等作用［３］；蟒蛇胆具有止咳、祛痰、平喘等作用［４］。此外，缅甸蟒因性情温顺可爱，也是世界流行的宠物。如此大的市场需求，导致野生蟒蛇急剧减少，加上蟒蛇传统栖息地面积的萎缩和数量的减少，使蟒蛇成为濒危物种。有数据显示，中国大陆的野生蟒蛇仅约６２ ０００条，且数量仍在减少［５］ 海南岛位于中国南部，与越南隔海相望。岛屿具有与陆地界限明确、受陆地物种影响小等独有特点，因此是研究物种进化、演替和新物种形成的绝好地理环境。海南岛蟒蛇具有这些特征。目前，关于越南缅甸蟒线粒体基因组全序列和来自海南缅甸蟒线粒体基因组全序列已经公布［６］，通过比对发现其在控制区ＩＩ位置变异最大。此外，人们在饲养过程中，发现同龄海南缅甸蟒与越南缅甸蟒在个体大小和生长速度上有显著性差异，因此有必要利用分子技术探讨这两种缅甸蟒遗传差异。 国内外学者利用线粒体上控制区、ＣＹＴＢ以及微卫星标记对缅甸蟒遗传多样性进行了研究［７－９］，取得了一定的研究成果，对于地方种群的来源、结构、种群多样性以及对入侵种群的管理有一定的参考价值，但目前关于海南缅甸蟒种群遗传多样性的研究国内外尚未见报道。为了更有效地保护、管理和繁育缅甸蟒濒危物种，特别是海南缅甸蟒，有必要采用现代分子遗传技术对种群进行群体遗传结构、遗传分化分析。本试验通过测定中国海南岛和越南的缅甸蟒控制区ＩＩ ３′端序列，研究两地方种群缅甸蟒遗传多样性，探讨海南与越南缅甸蟒遗传结构及遗传差异，以期能为海南和越南缅甸蟒的正确区分提供重要的科学依据。 １ 材料与方法 １．１ 样本采集 本试验从海南蟒蛇研究所的１０ ０００条蟒蛇中随机抽取海南缅甸蟒３７条、越南缅甸蟒２８条，采用心脏采血法每条抽取１．５ ｍＬ血液，柠檬酸钠抗凝，立即提取总 ＤＮＡ（参照天根 ＤＰ３０４离心柱型基因组提取试剂盒说明书操作），检测样品浓度和纯度，并稀释至１００ ｎｇ/μＬ，－２０ ℃分装保存。 １．２ ＰＣＲ扩增及克隆测序 ＰＣＲ扩增引物，上游引物序列为：５′－ＣＴＣＣＧＡＡＴＡＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣ－３’；下游引物序列为：５′–ＴＴＧＴＴＧＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴＧＧ－３′。ＰＣＲ扩增体系为５０ μＬ：Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ混合液２５ μＬ，总ＤＮＡ模板１００ ｎｇ，最后补水至５０ μＬ。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性３ ｍｉｎ；９４ ℃ 变性３０ ｓ，５０ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ。 ＰＣＲ产物经１％凝胶电泳检测，回收目的条带。将目的条带进行克隆测序。具体步骤：Ｔ４ ＤＮＡ连接酶作用下１６ ℃过夜→连接至ＰＭＤ２０－Ｔ载体→转化至大肠杆菌 ＤＨ５α→ＬＢ培养基培养1２ ｈ→挑取阳性克隆菌落→菌落ＰＣＲ验证→提取质粒→生工生物工程（上海）股份有限公司ＡＢＩ３７３０型全自动测序仪双向测序。 １．３ 序列分析 所得序列用ＤＮＡＳＴＡＲ ７．１０中的ＳｅｑＭａｎＩＩ进行序列校对及拼接。用ＢｉｏＥｄｉｔ７．０软件进行多重比对，ＤｎａＳＰ３．０统计多态位点、简约性位点、单倍型、核苷酸多样性（π）、单元型多样性（ｈ）、平均核苷酸差异数（ｋ）及中性检验。用ＭＥＧＡ ３．１基于Ｋｕｍａｒ ２－ｐａｒａｍｅｔｅｒ模型进行种群内遗传距离及分子系统分析，进化树中节点的自举置信度水平由自引导值（Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅ）估计，重复次数为１ ０００。利用Ａｒｌｅｑｕｉｎ ３．０１软件中分子方差分析（ＡＭＯＶＡ）估算两群体间的固定指数（Ｆｓｔ）。用Ｎｅｔｗｏｒｋ进行单倍型网络关系分析。 ２ 结果与分析 ２．１ 缅甸蟒控制区遗传多样性 在６５条序列中，碱基组成如下：Ｔ为２３．９％，