全血dna的提取及电泳.pptxVIP

第1页/共34页一、全血DNA的提取DNA1.实 验 原 理第2页/共34页第3页/共34页由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从而与白细胞相分离。通过SDS的破膜（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释放出DNA。然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质。最后用乙醇沉淀洗出DNA。第4页/共34页2.材料与方法⑴.材料用含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不会影响下游的反应。每5ml的血液中加入0.4ml 0.04M EDTA配好的EDTA溶液，颠倒混匀即可。保存于-20℃至-80℃，最好在2个月内提取。 第5页/共34页3%明胶，TES， Tris饱和酚（pH7.8），氯仿：异戊醇（24:1），无水乙醇，TE离心机，7ml离心管，1.5mlEP管，中试管，移液器第6页/共34页取1ml 全血等体积3%明胶颠倒混匀取上清弃上清⑵方法：Ⅰ 提取WBC溶液颜色均一37℃静置，5·10min溶液颜色上下分层3000r/min 离心 ，5min沉淀颜色为红色第7页/共34页Ⅱ 破碎WBC加入2ml TES溶液全部变为粉红色轻轻敲击管底震荡混匀加10滴10%SDS溶液颜色变暗颠倒混匀第8页/共34页上清夜（DNA）蛋白质层酚溶液上清夜（DNA）蛋白质层氯仿溶液Ⅲ 抽提DNA加等体积Tris饱和酚取下层酚溶液，混匀后溶液变为均一的棕色颠倒混匀，50次， 3000rpm，离心5min取上清加等体积氯仿：异戊醇（24:1）混匀后溶液变为均一的乳白色颠倒混匀，50次3000rpm，离心5min将上清移入试管第9页/共34页Ⅳ 沉淀DNA加2.5倍无水乙醇缓慢加入后，上下均为无色，但有分层面；吸取上层乙醇，轻轻吹打下层（油状）混匀。无水乙醇与水溶液交界面特点： 1.气泡 2.白色絮状沉淀吸出絮状沉淀到1.5mlEP管通风橱内放置5min挥干至无色液体加入100μ? ddH2O溶解第10页/共34页二、琼脂糖凝胶电泳1.原理⑴琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定以及纯化DNA或者RNA分子的方法。⑵这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。第11页/共34页⑶电泳介质 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物。沸水中溶解，45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小（孔径范围从50nm到大于200nm）决定于琼脂糖的浓度。第12页/共34页⑷.DNA分子的电荷效应： DNA在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。DNA带净电荷量的多少与电流强度，电泳缓冲液的pH值和离子强度有关。第13页/共34页M 1 2 3 4 5⑸. DNA琼脂糖电泳的分子筛效应： 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小、构型和琼脂糖的浓度是主要的影响因素。①DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。第14页/共34页②第15页/共34页③琼脂糖的浓度第16页/共34页⑹.示踪染料和分子量标准参照物①示踪染料： 有致癌性: EB，吖啶橙等; 无毒的染料：goldview I核酸染料等goldviewEB第17页/共34页② 分子量标准参照物（Marker）第18页/共34页3. 实验材料和试剂⑴实验材料： 全血基因组总DNA⑵.实验试剂：琼脂糖5×TAE电泳缓冲液6×电泳载样缓冲液（ 6× loading dye）： 0.25％ 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。goldview I型核酸染料： 每10 μl DNA加入2 μl染料。第19页/共34页⑶.实验仪器第20页/共34页凝胶成像系统第21页/共34页4. 操作步骤⑴.制胶1.0% 琼脂糖凝胶，0.5×TBE⑵.上样上样缓冲液⑶.电泳100V，20min⑷.观察紫外灯下观察第22页/共34页溶 胶第23页/共34页DNA: 8μl6×loading dye: 2μlTotal : 10μl上样准备 分别吸取上述体积的DNA和6×loading dye，至透明胶布的光滑表面，用移液器吹打均一。第24页/共34页凝胶冷却至50℃，加goldview I 2 μl摇匀第25页/共34页凝胶凝固后取出梳子第26页/共34页加缓冲液第27页/共34页准备样品第28页/共34页点 样第29页/共34页电 泳第30页/共34页注意观察溴酚蓝染液的迁移第31页/共34页紫外灯下观察电泳结果第32页/共34页照 相