土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法).docxVIP

一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖 酶的活性。二、试剂1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用 50%的乙醇溶至 100ml。 3）pH5.5 醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至 1L； 0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na 或 27.22g C2H3O2Na.3H2O 溶至 1L； 取 11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和 88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成 PH 5.5 醋酸盐缓冲液。 4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称 1.25g 二硝基水杨酸，溶于 50ml 2mol/LNaOH 和 125ml 水中， 再加 75g 酒石酸钾钠，用水稀释至 250ml（保存期不过 7 天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置 80℃烘箱内约 12 小时。准确称取 50mg 葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL 容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸 1mg/mL 的标准葡糖糖溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至 1mL，加 DNS 溶液 3ml 混匀，于沸腾水浴中加热 5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm 处比色，以 OD 值为纵坐标，以葡萄糖 浓度为横坐标绘制标准曲线。 称 10g 土壤置于 50ml 三角瓶中，加入 1.5ml 甲苯，摇匀后放置 15min，再加 5ml 1%羧甲基纤维素溶液和 5ml pH5.5 醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养 72h。培养结束后，过滤并取 1ml 滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样 品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。） 四、结果计算 纤维素酶活性以 72h，1g 干土生成葡萄糖毫克数表示。纤维素酶活性=（a 样品－a 无土－a 无基质）×n／m 其中：a 样品、a 无土、a 无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n 为分取倍数； m 表示烘干土重