蛋白质的纯化与鉴定.pptVIP

疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，它也属于吸附层析一类, 通过表面疏水性的差异来分离蛋白质的柱层析方法。 一、疏水层析的原理 第86页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。 在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱顺序为Tyr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。 第87页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 第88页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 （一）疏水作用 蛋白质与固定相结合原理 蛋白质表面存在的疏水补丁 蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分子内部的疏水残基暴露至分子表面 疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水残基容易与疏水性固定相结合 洗脱原理 通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐渐洗脱） 第89页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 （二）吸附剂 根据基质的性质不同分为： 1.亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖（Sepharose）, 配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成 特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统 2.非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合 特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，特别适用于高压层析（如HPLC等） 第90页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 二、操作 1.制备层析柱 2.加样与洗脱 3.层析柱再生 第91页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 Equilibration 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Equilibrate the column and adjust the sample to binding conditions Hydrophobic ligand Gel matrix Water molecules 第92页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 Sample application 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Gel matrix Proteins Hydrophobic groups 第93页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 Washing out unbound material 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Conc. salt Abs Non-bound proteins 第94页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 Elution 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Target elutes Conc. salt Abs 第95页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 Elution Conc. salt Abs 1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution More strongly bound proteins 第96页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 样品的准备： 往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与平衡液基本一致，并调节样品溶液的pH使其满足吸附条件 。 HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样 第97页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 洗脱的方式： 采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）； 通过往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱 （溶剂中稳定性良好的物质） 往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白） 第98页，共110页，2022年，5月20日，4点48分，星期六 洗脱理论： 疏溶剂理论：