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三.外源基因整合的分子检测PCR检测 利用PCR扩增检测外源基因整合时，要以被检组织DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。若被检植株基因组DNA中含有外源基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。非转化植株基因组DNA中不含有外源基因，则无特异性扩增条带出现。 注意：PCR扩增可以扩增选择标记基因，也可扩增目的基因。标记基因的存在并不能完全代表目的基因的存在 第63页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 ◆ PCR反应包括三个步骤： ●变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。 ●复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60℃ ●延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链 ◆ 这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外快速扩增DNA的方法 第64页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 PCR产物可以通过电泳检测 琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第65页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 * 特异性PCR检测外源基因整合到受体 第66页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的PCR扩增结果（M为分子量标准，C为非转基因植株，P为质粒对照，1-20为转基因植株） 第67页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 Southern杂交 Northern杂交 细胞原位杂交 常用的转基因生物分子检测手段有 四、核酸分子杂交技术检测转基因 第68页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 转基因植物鉴定所涉及的核酸分子杂交有: Southern杂交是以已知DNA或RNA为探针，检测目标DNA的存在，用于外源目的基因整合的鉴定及分析。 Northern杂交是以已知DNA或RNA为探针，检测特异的mRNA分子的存在，用于外源目的基因转录产物（mRNA）的检测。 细胞原位杂交是一项组织化学与分子杂交相结合的技术，用来检测组织细胞内目标DNA或RNA分子存在位置，采用这一技术可以确定整合有外源基因 的染色体及外源基因在染色体上的位置。 另一类似的技术是Western蛋白质杂交，它是利用抗原与抗体特异结合的原理检测外源目的基因表达产物特异蛋白的生成。 第69页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 * 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交：是指一条单链核酸分子（DNA或RNA）通过碱基互补与另一条单链核酸分子形成稳定双链的过程。 基本原理： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C ; 变性： 升高温度至94℃左右，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 缓慢降低温度（ 52℃左右），变性的两条单链重新形成 互补双链。 碱基互补: 第70页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 1.Southern杂交(Southern blotting) ◆将DNA用限制性酶酶切→酶切DNA电泳→变性→转移到膜上→经过标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交→洗去膜上非特异性结合的探针→检测杂交信号 。 ◆如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。 此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。 第71页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 该方法是Marton等1979年以原生质体为受体建立起来的，随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。该方法的主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。 A.原生质体共培养法 取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。 第31页，共90页，2022年，5月20日，13点55分，星期六 ①从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。 ②原生质体与农杆菌混