G418筛选稳定表达细胞系经验总结.docVIP

(完满版)G418优选牢固表达细胞系经验总结 (完满版)G418优选牢固表达细胞系经验总结 PAGE/NUMPAGES (完满版)G418优选牢固表达细胞系经验总结 G418优选牢固表达细胞系经验总结 我做了牢固转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化判断。有自己的领悟也有其 他战友碰到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。 优选以前确定G418浓度： 1、由于每种细胞对G418的敏感性不一样，而且不一样的厂家生产的G418有效成分的比重不一样，一般1g的粉剂中有效的G418含量大概为0.722g。 2、G418是新霉素的近似物，两者都是经过控制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细 胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码 3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜碰到 影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染 时不加其他抗生素。 3、会合度对G418优选结果的影响很大，一般优选时会合度不宜高出50% 4，G418的活性不尽相同，所以在优选以前，必然要确定G418的最正确优选浓度。详尽如 下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行优选， 选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的优选试