基因的体外转录和翻译.pptVIP

第二节 基因的体外翻译 基因体外翻译的目的和意义 基因的体外翻译是将基因转录产物RNA在离体条件下直接合成蛋白质的过程。 体外翻译的实验方法主要用于： 1、基因产物的快速确定； 2、基因突变体的快速和分析； 3、蛋白质活性研究； 4、众多基因产物的同时表达； 5、大分子间的相互作用； 6、影响翻译过程的物质检出； 7、表达对细胞有毒性的蛋白和易于被细胞内蛋白酶降解的蛋白和形成不溶包含物的蛋白。 基因体外翻译的基本原理 基因体外翻译的基本原理是以基因转录产物RNA为模板，在核糖体上进一步生产蛋白质的过程。 基因体外翻译的模板： 1、直接来自体外基因转录实验； 2、细胞内提取的mRNA； 3、通过PCR或RT-PCR产物转录后的RNA。 利用不同模板和翻译体系进行翻译时，应匹配相应的翻译起始序列。如用原核细胞翻译体系时RNA模板应含有SD序列，应用真核翻译体系时，应有帽子结构；在RNA的3ˊ未端含有合适的终止信号。 基因体外翻译的基本实验流程 体外翻译系统的制备：该系统为基因体外翻译提供必要的条件。 1、核糖体：是蛋白质合成的装配机； 2、环境条件：如离子、翻译过程中所需的各种因子等。 常用的翻译系统的制备： 1、细胞裂解物的制备 (1)收集一定数量生长良好的细胞，于10ml培养液中，1500rpm离心5min。得细胞沉淀，用漂洗2次； (2)用10倍细胞体积的预冷缓冲液裂解细胞 (1%Triton X100，150mmol/LNaCl，，1mmol/LEDTA，1mmol/L EGTA，，％NP-40)（EGTA：乙二醇二乙醚四乙酸；PMSF：苯甲基磺酰氟；NP-40：壬基酚聚氧乙烯－40醚）； (3)裂解液4℃下搅动5min，16000g离心15min后，上清液即为细胞裂解物。 细胞的主要来源：酵母细胞、麦芽组织细胞、兔网织红细胞和Hela细胞。 2、细胞核糖体的分离： (1)收集一定数量的成纤维细胞，迅速放于冰上，4℃ 600g离心10min，收集细胞沉淀，用预冷的TBS悬浮细胞并洗涤3次。 (2)用2倍体积的TBS-M(10mool/LTris.Cl,pH7.5,10mmol/L KCl和乙酸镁)悬浮最后的细胞沉淀，0 ℃放置5min，在匀浆器中匀浆10~20次。 (3)每匀浆液加浓缩的10*TBS-M缓冲液，混合，4 ℃ 10000g离心10min。 (4)收集上清提取物，在提取物中加入ATP，GTP磷酸肌酸，肌酸激酶及各种氨基酸。 (5) 37℃培养45min。 (6) 室温下10000g离心混合物10min，冷却上清，在4℃ 条件下进行SephadexG-25柱层析。收集260nm吸收峰，4 ℃ 165000g离心90min 。 (7) 加入饱和的(NH4)2SO4的终浓度为60%，经离心收集沉淀。在含有蔗糖的TBS缓冲液，悬浮有核糖体的液体放在上层， 4 ℃216000g离心。用TBS-M缓冲液洗涤沉淀，悬浮在具有蔗糖的同一缓冲液中。 (8) 用UV光谱仪测A260，确定核糖体浓度。 基因的体外翻译反应 基因体外翻译一般在25~35℃温度条件下进行，反应体积在40~100ul之间，反应体系中主要有： 5或10倍的翻译缓冲液10~30ul转录产物，20~50ul细胞裂解物或1~3个A260的核糖体分离物，40~100uCi甲硫氨酸，蛋白酶抑制剂 用mRNA模板和进行体外翻译 用分离纯化的mRNA为模板，在分离纯化的核糖体上进行蛋白质合成。 优点：可以进行蛋白质合成中的各种影响因子的分析和蛋白质合成速度的比较分析 缺点：分离核糖体的过程比较复杂，反应条件相对严格 体外蛋白质快速合成体系 此方法把体外基因转录和体外蛋白质翻译放在一个体系中进行，即基因转录后直接进行蛋白质翻译的过程。 优点：可以快速检测目的基因在体外的表达情况 缺点：不能对基因转录和蛋白质翻译过程的细节进行分析 什么是基因的体外转录和翻译 基因的体外转录和翻译是20世纪70年代发展起来的一项分子生物学和细胞生物学实验技术，是研究离体条件下(非细胞体系)基因表达情况的理想体系。 基因表达包括：转录和翻译两个过程。 基因表达的调控包括：染色体结构的调节、DNA结构的调节、转录过程的调控、转录后的调控、翻译过程的调控及翻译后的调控。 基因体外转录和翻译的作用：为研究基因转录和蛋白质翻译提供了一个十分理想实验体系和技术平台及找到了一个研究与探讨转录和翻译这两个复杂的现象的重要手段和方法。 第一节 基因的体外转录 一、基因体外转录的目的和意义 基因的体外转录体系最早由Pelham和Jakson于1976年创立的，经很多实验室的不断修订和改进，现已成为一项成熟的分子生物学和细胞生物学技术，已被多家试剂公司提供标准的实验程序。 基因体外转录体系在分子生