细菌内毒素检测 4、光度法检查技术.pptx

光度法细菌内毒素 检查技术 湛江安度斯生物有限公司 2016年7月 1 实验助手APP授权发布 光度测定法 • 光度测定法方法学分类 1 2 3 4 5 6 • 光度测定法原理 • 试验器具 • 标准曲线的可靠性试验 • 干扰试验 • 检查法 2 （一）光度测定法方法学分类 动态浊度法 浊度法 终点浊度法 光度测定法 动态显色法 终点显色法 显色法 3 （一）光度测定法方法学分类 浊度法：动态/终点 • 检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化。 显色法：动态/终点 • 检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固 酶使特定底物释放出呈色团的多少。 4 （二）光度测定法原理 • 1.光电转换原理 – 光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程 的吸光度或透光率变化与内毒素浓度的关系来定量检测 内毒素的一种方法。 – 当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电 流I，我们称I为透光强度。 透光容器 反应混合物 I 入射光 透射光 光电池 5 I Is It Ie T(分) • 设：初始时的透光强度为Is，某时刻的透光强度为It 定义1：透光率（Rt）： R =I /I (%) t t s  初始时I =I ，R =100%，R 曲线变化趋势是由高至低。 t s t t 定义2：吸光度(OD)： OD= -lg(It/Is)  初始时It=Is，OD=0，OD曲线变化趋势是由低至高。 • 选择不同的参数(R 或OD)将得到不同变化趋势的动态曲线。 t 6 反应动态曲线(Rt-T曲线) • 以透光率（Rt）为纵座标，时间（T）为横座标，把鲎试 剂与内毒素反应引起反应混合液透光率的变化连续地描 绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图： Rt（%） 100 反应动态曲线 T（分） 孵育期 反应期 结束期 7 反应动态曲线(OD-T曲线) • 以吸光度（OD）为纵座标，时间（T）为横座标，把鲎试 剂与内毒素反应引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘 在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图： OD 反应动态曲线 T（分） 0 结束期 孵育期 反应期 8 2.动态曲线的特点 • 把标准内毒素制备成三个浓度C 、C 、C 1 2 3 （C C C ），分别与鲎试剂反应，描绘出反应的 1 2 3 动态曲线如下图：分析动态曲线可看出： 1. 内毒素浓度越高，孵育期越短； OD 2. 内毒素浓度越高，反应期曲线越陡； 3. 内毒素浓度越高，进入结束期越快。 C3 C2 C1 T（秒） 9 3.光度法BET试验的相关变量 相关变量： OD 内毒素浓度(C) Rt或OD 反应时间(T):不同的方法 有不同的意义 C3 C2 C1 T（秒） 常数：固定反应时间值终点法 固定Rt或OD值动态法 10 4.动态法原理 • 固定吸光度或透光率，检测反应混合物的吸光度或透光率达到 某一预先设定的检测值所需要的反应时间。 • 建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线（C-T曲线）。 • 用供试品的反应时间比对标准曲线，得出供试品的浓度。 • 预设Rt或者OD值应按照试剂生产商的建议及使用的鲎试剂和 仪器类型进行设定。 11 （1）建立标准曲线 OD LgT LgT=b-kLgC T3 回归分析 C3 C2 T2 T2 C1 预设OD T1 0 T1 T3 T(秒) C3 C2 C1 LgC 12 （2）测定供试品内毒素浓度（Cs） • 用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品(S)反应，得到 反应时间Ts，比对C-T关系的标准曲线，可得出供试 品的内毒素含量Cs。 LgT OD LgT=b-kLgC 供试品 比对标准曲线 Ts 预设OD 0 LgC Ts T(秒) Cs 13 预设OD或Rt的选择 OD 分辨率好但需要增加时间 最佳预设OD 标准内毒素浓度之间的分辨率不好， 容易受到背景噪声影响 反应时间 预设值一般由鲎试剂生产商建议，并注明在鲎试剂说明书中 14 5.终点法原理 • 固定反应时间（T），依据反应混合物中内毒素浓度 和其在孵育终止时的吸光度或透光率之间存在的量化 关系来测定内毒素含量的方法。 • 建立内毒素浓度与吸光度或透光率关系的标准曲线 （C-OD曲线或C-Rt曲线），用供试品的吸光度或透 光率比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。 15 （1）建立标准曲线 OD 预设反应时间（T） OD1 OD OD=k*C+b OD1 回归分析 OD2 C1 C2 C3 OD2 OD3 OD3 0 T(秒) C3 C2 C1