细菌内毒素检测 5、动态显色法鲎试验及其在药品生产质控上的应用.pptx

动态显色法鲎试验及其在 药品生产质控上的应用 •湛江安度斯生物有限公司 •2016年6月 实验助手APP授权发布 1 一、药典接受的鲎试验方法 限度试验 凝胶法 （Gel-clot） 半定量试验 细菌内毒素检查法 （BET） 动态浊度法 (KTA) 浊度法 显色法 终点浊度法 (ETA) 光度法 （Photometry） 动态显色法 (KCA) 终点显色法 (ECA) 2 二、动态显色法鲎试验的原理与特点 1. KCA鲎试验原理 内毒素 凝固酶原 凝固酶 + 显色寡肽 寡肽 pNA（黄色） 动态法光度分析 3  显色寡肽：一种人工合成的三肽或四肽，俗称鲎三 肽或鲎四肽，又称显色基质或显色底物。寡肽的末 端连接着一个成分为对硝基苯胺（pNA）的显色基 团。  在无凝固酶状态时，含有显色寡肽的溶液是无色透 明的。当溶液含有内毒素，内毒素激活鲎凝固酶原 成为凝固酶，凝固酶会特异性地切断连接显色基团 的肽链，使显色基团与显色寡肽分离。游离的显色 基团呈黄色。  使用动态光度仪分析反应溶液的光度变化，可以定 量地测定溶液中的内毒素含量。通常使用405nm光 源进行光度分析。 4 2.KCA鲎试验特点 灵敏度高 在所有的鲎试验方法中，KCA鲎试验的灵敏 度最高。 在常规的鲎试验条件下（37℃/60分钟）， KCA鲎试验的灵敏度可达0.005EU/mL。 灵敏度高的原因在于显色寡肽的应用。 5 检测范围广 在所有的鲎试验方法中，KCA鲎试验的检测 范围最广。 在常规的鲎试验条件下，KCA的检测范围可 达10,000倍（50~0.005EU/mL），标准曲 线相关系数|r|≥0.998。 线性是衡量检测能力的重要指标。 KCA线性好的原因同样在于显色寡肽的应用。 6 动态浊度法(KTA) Y轴 Log（时间） 0.005EU/mL 0.05EU/mL 0.5EU/mL 5EU/mL 50EU/mL X轴 Log（浓度） 7 Y轴 Log（时间） mL 8 抗干扰能力强 KCA鲎试验是基于显色的速率来测定样品的内 毒素，通常影响凝胶法鲎试验的凝胶生成的干 扰因素或影响浊度法鲎试验的浊度生成的干扰 因素不会影响KCA鲎试验的显色反应。 专门针对鲎凝固酶设计的显色寡肽对显色反应 有极为专一的特异性，使KCA鲎试验的抗干扰 能力大大强于其它方法的鲎试验。 9 节约鲎资源 目前还没有比鲎试验更好的检测内毒素或热 原的方法。在未来的一定时期内，鲎试验仍 然是检测内毒素的最灵敏、最快速、最方便 和最经济的方法。 鲎试验需要消耗珍贵的鲎资源。今天地球上 的鲎资源已经越来越少。 在KCA鲎试验中，有一部分的酶促反应功能 已被显色寡肽所取代，因此它需要的鲎溶胞 物只是凝胶法或浊度法鲎试验的40~60%。 10 三、药品生产质控对鲎试验的要求 与药品放行检查的鲎试验（BET）比较，药 品生产质控对鲎试验有着特殊的要求： 1. 灵敏度更高； 2. 抗干扰能力更强； 3. 检测范围更宽； 4. 检测时间更短； 5. 实验操作方便快捷； 6. 检测结果准确可靠； 7. 试验成本越低越好。 11 根据药品生产质控对鲎试验的要求，比较 现行的各种鲎试验方法，最适合生产质控应用 的就是动态显色法鲎试验（KCA TAL test）。 下面，介绍湛江安度斯生物有限公司专门 为药品生产质控设计的一套MKCA鲎试验系统。 12 四、微板法动态显色鲎试验系统 （MKCASystem） Ⅰ.系统组成 1.光度分析仪：采用赛默飞FC/ET型酶 标仪 • 仪器特点：具有振板、37℃恒温孵育 和动态数据采集功能。 13 2. 内毒素检测专用软件：生物探针5版 14 3. MKCA鲎试剂：12次试验/支 15 4. 光度法内毒素工作品系列：H、M、L 16 5. 细菌内毒素检查用水：内毒素＜0.003EU/mL 6. 无热原采样瓶 17 7. 专用微孔板（酶标板） 18 8. 移液器具 19 Ⅱ.MKCA系统应用举例 1. 标准曲线及阳性产品对照的制备。 • 利用光度法内毒素工作标准品系列制备标准曲 线。 – H、M、L分别代表高、中、低3个浓度。 • 将待测样品溶液加入M瓶中，制备样品阳性对 照。 （实验演示视频1） 20 2.生产过程内毒素的快速测定 假设：某种药品的生产在某一关键工 序时要对其半成品（S）的内毒素含量进 行监控。 21 实验步骤： （1）实验计算及预试验 （2）比对反应曲线制备 （3）日常生产快速测定 22 （1）试验计算及预试验  半成品S，设其浓度为20mg/mL  该药品的内毒素限值：L=0.2EU/mg  设生产控制限值为h，h 取1/4L =