细菌内毒素检测 2、《中国药典》 2015年版BET法.pptx

《中国药典》 2015年版BET法 湛江安度斯生物有限公司 2016年6月 实验助手APP授权发布 1 《中国药典》 2015年版BET法 四部通则1143 综述 BET 实验 2 1.综述部分 • 细菌内毒素检查法的定义及方法学分类 • 细菌内毒素标准品和检查用水 • BET操作和器具的要求 • 供试品溶液的制备 • 内毒素限值的确定 • 最大有效稀释倍数和最小有效稀释浓度的 计算 3 2.实验部分 • 凝胶法 • 光度测定法 – 鲎试剂灵敏度复核试验 – 干扰试验 – 标准曲线的可靠性 试验 – 干扰试验 – 检查法 – 检查法 • 凝胶限度试验 • 凝胶半定量试验 4 3.2015年版与2010年版ChPBET法主 要不同点 明确仲裁方法 项目 2010年 2015年 仲裁方法 以凝胶法结果为准 以凝胶限度试验结果为准 操作要求 应防止微生物和内毒 应防止内毒素的污染”； 素的污染” 删除“微生物”。 避免误解 细菌内毒 用于标定、复核、仲 用途增加：干扰试验及检 素国家标 裁鲎试剂灵敏度和标 查法中编号 B 和 C 溶液的 准品用途 定细菌内毒素工作标 制备、凝胶法中鲎试剂灵 准品的效价 敏度复核试验、光度测定 法中标准曲线可靠性试验。 5 项目 2010年 2015年 细菌内毒素 用于试验中的鲎试剂灵 用于干扰试验及检查法中 工作标准品 敏度复核、干扰试验及 编号B和C溶液的制备、 用途 各种阳性对照  凝胶法中鲎试剂灵敏度复 核试验、光度测定法中标 准曲线可靠性试验 供试品溶液 供试品溶液的pH 值在 供试品溶液和鲎试剂混合 pH值的要求 6.0～8.0的范围内 后溶液的pH 值在6.0～ 8.0的范围内 λc=antilg（∑X/n）； n 为每个浓度的平行管数 λ 计算公式 λ ＝antilg （∑X / 4 ) c c 干扰试验 方法：溶液C各平行4管 方法：溶液C各平行2管 判断：0.5λ≤Es≤2λ； 判断：溶液C和溶液B的 0.5Es≤Et≤2Es 结果，符合鲎试剂灵敏度 复核试验的要求。 6 项目 2010年 2015年 凝胶半定量 结果判断 系列溶液A中每一系列平行 系列溶液A中每一系列的终点 管的终点稀释倍数乘以λ，为 稀释倍数乘以λ，为每个系列 每个系列的反应终点浓度， 的反应终点浓度，如果检验 所有平行管反应终点浓度的 的是稀释过的供试品，则将 几何平均值即为供试品溶液 终点浓度乘以供试品进行半 的内毒素浓度〔按公式 定量试验的初始稀释倍数， C =antilg（∑X/2）〕。 即得到每一系列的内毒素浓 E 若内毒素浓度小于规定的限 度C。 值，判定供试品符合规定。 若每一系列内毒素浓度均小 若内毒素浓度大于或等于规 于规定的限值，判定供试品 定的限值，判定供试品不符 符合规定。每一系列内毒素 合规定。  浓度的几何平均值即为供试 品溶液的内毒素浓度〔按公 式C =antilg（∑C/2）〕。 若任何系列内毒素浓度不小 于规定的限值，则判定供试 品不符合规定。 E 7 项目 2010年 2015年 凝胶限度 供试品溶液：稀释倍 供试品溶液：稀释倍数不 试验 数为MVD 超过MVD 结果判断：/ 增加：若供试品的稀释倍 数小于 MVD 而溶液 A 出 现不符合规定时，需将供 试品稀释至 MVD 重新实验 再对结果进行判断。 动态浊度 是检测反应混合物的 是检测反应混合物的浊度 法定义 浊度到达某一预先设 到达某一预先设定的吸光 定的吸光度所需要的 度或透光率所需要的反应 反应时间，或是检测 时间，或是检测浊度增加 浊度增加速度的方法。 速度的方法。 8 项目 2010年 2015年 动态显色 动态显色法是检测反 动态显色法是检测反应混 法定义 应混合物的色度达到 合物的吸光度或透光率达 某一预先设定的吸光 到某一预先设定的检测值 度所需要的反应时间， 所需要的反应时间，或检 或检测色度增长速度 测值增加速度的方法。 的方法。 光度法结 当阴性对照的反应时 阴性对照的吸光度或透光 果判断 间大于标准曲线最低 率小于标准曲线最低点检 浓度的反应时间 测值或阴性对照的反应时 间大于标准曲线最低浓度 的反应时间； 9 供试品溶液pH值的要求 2010年版 2015年版 •一般要求供试品溶液的pH值 •必要时，可调节被测溶液 在6.0～8.0的范围内。对于过 （或其稀释液）的pH值，一 酸、过碱或本身有缓冲能力的 般供试品溶液和鲎试剂混合 供试品，需调节被测溶液（或 后溶液的pH值在6.0～8.0的 其稀释液）的pH值，可使用 范围内为宜，可使用酸、碱 酸、碱溶液或适宜的缓冲液调 溶液或适宜的缓冲液调节pH 节pH值。 值。 10 供试品溶液PH值的要求 鲎试剂本身具有缓冲能力