细菌内毒素检测 9、常见干扰及消除.pptx

常见干扰及消除 湛江安度斯生物有限公司 2016年7月 实验助手APP授权发布 BET干扰的普遍性！ 70%！ • 一项对人用药品与鲎试验相容性的研究证实 了干扰的影响范围，在所研究的品种中仅 30%的药品可以不经任何处理直接进行BET； 有97%的干扰问题可以通过稀释供试品的方 法去消除。 2 干扰的表现 • 凝胶法 ChP（2015年）规定无干扰条件： 当溶液A和溶液D的所有平行管都为阴性，并 且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验 要求时，试验方为有效。 当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试 验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。 3 干扰的类型 • 抑制 – 供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏 度，但检测结果仍为阴性，称之为假阴性。 • 增强 – 供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度 的1/2，但检测结果仍为阳性，称之为假阳性。 4 光度法的判断？ 无干扰可接受范围：50%≤回收率≤200% 抑制：回收率＜50% 增强：回收率＞200% 无干扰 抑制 增强 200% 50% 干扰的判断：回收率=？% 5 干扰的因素！ 聚集 pH值 脂质体 二价阳离子 浓度不足 鲎试剂 内毒素 吸附 高渗透压 酶、酶抑制剂 洗涤剂 表面活性剂 LAL-RM 6 pH值的影响 鲎试剂中的酶需要在pH值6~8的范围内才能正常反 应，极端的pH环境影响酶的活性，造成抑制 一般来说鲎试剂配方中都添加了缓冲剂以帮助样品的 pH值的调节，但这不足以解决所有样品的pH问题 测定以1:1为比例混合的样品稀释液+鲎试剂的pH值 以获得准确的pH值 7 解决有关pH的问题 • 用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释 1 2 3 • 用缓冲液制备供试品 • 用酸、碱或缓冲液来调节pH 8 二价阳离子浓度不足 Mg 离子是鲎试剂重要的辅因子，没有Mg 离子，内毒素 2+ 2+ 将无法激活鲎试剂的酶。 供试品中的螯合剂成分会螯合试剂中的二价阳离子（如Mg2+ 离子），造成抑制 常见的螯合剂有：EDTA、柠檬酸钠、肝素钠、喹诺酮类药物 等 9 解决二价阳离子浓度不足问题 • 用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释 1 • 使用含Mg 或Ca 离子的稀释剂稀释样品，降低活 2+ 2+ 2 性螯合剂含量 • 注意过高的二价阳离子（如Ca2+）浓度可能会带来 抑制 3 10 高渗透压问题 较高浓度的糖或者盐通常会抑制鲎试剂反应，如50%葡萄糖或 5%氯化钠溶液。 高渗透压的溶液会从鲎试剂吸水，从而使酶失活，造成抑制 使用BET水在允许范围内进行稀释可消除干扰 11 酶、酶抑制剂问题 鲎试剂的凝固酶属于一种丝氨酸蛋白酶，供试品中若含有类似 的丝氨酸蛋白酶（常见于血液制品）会导致鲎试剂的反应，造 成增强 一些人血浆制品（如人血白蛋白、静注用IgG等），作为原料 的血浆和血清中的丝氨酸蛋白酶抑制剂会抑制LAL凝固酶与内 毒素的反应活性，造成抑制 通常来说较为简易的一种消除干扰的方法是：使用BET水稀释 10倍，然后使用75℃加热10分钟 12 内毒素聚集问题 提纯的内毒素没有自然存在的内毒素稳定，其稳定性 没有环境内毒素强 内毒素分子的两亲性使其容易自身聚集成团，成为更 大的分子，效价也会下降 13 解决内毒素聚集问题 • 新鲜制备标准品溶液或按说明书要求制备 1 2 3 • 如果内毒素标准品溶液需要储存，必须验证其储 存条件是否会影响其活性 • 经常旋涡混合含有标准内毒素的溶液 14 脂质体问题 脂多糖的两亲性会使其对一些具有疏水基团的产品具有亲和 力（如脂类、磷脂、脂蛋白、大分子量血浆蛋白）。脂多糖 与这些特定产品的结合后会使其的大小和形状受到影响，以 至于影响活性，使得内毒素试验受到干扰。 使用内毒素分散剂稀释样品可以使内毒素从供试品中分离出 来，恢复内毒素的活性 15 内毒素吸附问题 一些试验器具会对内毒素有吸附作用 首选硼硅酸玻璃，第二聚苯乙烯材料 不要用聚丙烯材料，它会加剧内毒素的损耗 （吸附） 提防塑料包装溶出物带来的干扰 16 非内毒素反应物（LAL-RM） β-葡聚糖是造成鲎试验结果假阳性的一个已知来 源 用抗增液复溶鲎试剂可以消除大多数的葡聚糖干 扰 不同厂家的鲎试剂配方不同，请使用专用的抗增 液，不要随意混用 17 USP关于β-葡聚糖的描述 USP的细菌内毒素检查法要求： “除了内毒素，鲎试剂还与某些β-葡聚糖 反应。一些经处理而制备的鲎试剂不会 与β-葡聚糖反应，应使用这种鲎试剂检 测含葡聚糖的样品” 18 提防洗涤剂（表面活性剂）！ 需要注意，无论是生产工艺上使用到的洗涤剂（或表面活性剂），还是器 具上残留的洗涤剂都会对鲎试验造成干扰 高浓度的洗涤剂使鲎试剂的蛋白变性，失去活性