临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法.pptx

2018-5-14 检验科 临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法 肿 病 瘤 原 分 新 个 体 子 产 生 体 核 遗 前 儿 化 酸 传 诊 筛 检 检 检 断 查 测 测 测 唐 羊 无 四 新 新 液 组 性 乙 呼 药 耳 氏 水 创 病 生 生 态 织 病 肝 吸 物 染 聋 烟台市烟台山医院检验科 崔金鹏 色 筛 细 产 筛 儿 儿 活 检 三 等 道 代 基 项 病 谢 体 因 查 胞 前 查 耳 遗 检 测 原 酶 微 检 核 聋 传 体 检 缺 测 型 基 代 失 分 因 谢 测 筛 析 检 病 查 测 筛 查 病人识别 病人准备 设备校准 PCR扩增 性能评价 精密性 重复性 携带污染 标本采集 采集质量评价 标本运送 标本评价 标本保存 核酸提取 质量评价 实验室外 l 血清（浆） l 全血 结果评价 报告发放 指导诊断 l 痰 实验室内 l 拭子 l 脓液 Analytical Phase Post-analytical l 体液 l 干血片 l 组织 l 骨髓穿刺样本/细针穿刺细胞 常规项目 l l 对于DNA测定的标本，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大。 对于RNA测定的标本（如HCV），抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标 本，则需尽快(2小时内)分离血清，72h内提取RNA则可放置在4℃下。标本 的短期（15天内）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃下。 l l 抗凝剂不能有肝素 尽快分离血浆是核酸不被降解的关键步骤。 室温下不同保存时间对血清 HCV-RNA检测的影响较小 1 2018-5-14 血清反复冻融对HCV-RNA检测的影响较小 不分离血清对弱阳性标本 HCV-RNA检测的影响较大 Circulating cell-free DNA Serum Serum EDTA-plasma EDTA-plasma 内源性DNase活性测定 外源性DNase I的降解能力 Circulating cell-free DNA BRAF A1/A2-105bp BRAF A1/B2-288bp 反复冻融血浆2次以上对cfDNA影响较大 2 2018-5-14 Circulating cell-free DNA 全血保存于Streck采血管3天后分离血浆 Circulating cell-free DNA 1. 使用EDTA抗凝采血管，不能使用肝素 ; 2. 检测样品应为血浆而非血清，避免标本反复冻融； 3. 采血后混匀动作要轻柔 ; 4. 如果不能及时处理应使用专用采血管， 标本运送时 常温运送； 5. 应根据试剂或试管的说明书进行必要的调整。 l 全血标本主要是提取单个核细胞中的核酸： 基因组DNA、线粒体DNA和总RNA等 l 单个核细胞的制备途径： 1. 使用淋巴细胞分离液分离制备 2. 使用红细胞裂解液裂解全血中的红细胞，再经过生理 盐水洗涤即可得到白细胞 l 单个核细胞如果不提取核酸，可保存于 -70℃。 l 严禁反复冻融，如果不能保证低温则应使用专用采血管 l 需要提取细胞内总RNA的标本，应迅速保存于 -70℃下，否则应使 用含有RNA保护成分的专用采血管保存。 室温保存不同时间对RNA总量的影响 不同温度保存对RNA总量的影响 3 2018-5-14 全血-循环肿瘤细胞 循环肿瘤细胞富集技术 稀有性 抗原特异性 非典型形态 阴阳性富集技术比较 阳性富集 阴性富集 l l l 用PCR方法检测性病病原体时（衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、 HPV和流感病毒等）临床标本一般为拭子。 CTC 标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到 细胞。 白细胞 磁珠 处理时将拭子置于适量的生理盐水中，充分震荡洗涤后，室温静止 5-10 分钟，取上清，离心后的沉淀，经生理盐水洗涤一次后，沉淀可用于核 酸提取 免疫染色 l 使用具有细胞保护液的专用保存管保存样本。 4 2018-5-14 粘稠脓液 水样脓液 l l 临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸为 DNA，可室温保存数月 至数年，如靶核酸为 RNA，则可稳定数周。 分枝杆菌 非分枝杆菌 直接离心 同痰液 加入适量 生理盐水 保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为标本中的 PCR抑制物如血 红蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测造成 影响。 震荡，静置 取上清后离心 沉淀 沉淀 沉淀 l l 不管是全血、血清（浆），还是尿液、粪便、分泌物等均可此种方法。 采血后，室温静置4小时，血片彻底干后再保存。 核酸提取 RNA稳定和储存溶液 l经典方法 原理： 短时间内迅速渗入细胞，特异性抑制细胞 内的Rnase活性，从而保证RNA的完整性。 l煮沸法 商品化试剂盒 注意： a.