大学生创新创业训练计划结题报告——酵母MCM4亚基随机突变分析.docxVIP

酵母MCM4亚基随机突变分析 1工程简介 我们对基因修复及基因组复制的相关机制有很大的兴趣，酿酒酵母是研究真 核基因组复制的模式生物，而MCM (minichromosome maintenance)，是在酵母 细胞复制中结合在DNA链的六聚体，MCM有2至U 7六个亚基，它们形成MCM2-7 helicase complex六聚体环状结构,在真核生物DNA复制的起始和延伸都扮演着 重要的角色，尤其是在形成复制叉和延伸的时候，MCM是复制前复合物的一种成 分。现在大多数人认为MCM有解旋酶的作用，但是它们具体的作用机制还不是很 清楚。我们想针对其中的一个亚基MCM4进行相关的实验，探讨MCM4可能的作用， 进而了解与MCM4有关的DNA复制的机制。 2实验方法 我们的课题是对mcm4这一在DNA复制起始中起重要作用的蛋白的随机突变, 我们希望得到酵母中mcm4新的有表型的突变体。通过查阅文献，了解到随机突 变的策略大体上有两种：一种策略是将编码目标蛋白的正常的基因导入易错突变 的大肠杆菌中，通过其DNA复制时的低保真度获得目标基因的随机突变，再将突 变了的基因导入酿酒酵母中，检测其是否具有温度或者药物敏感表型；第二种策 略是采用易错突变PCR的方法，在扩增目的片段时通过改变PCR的条件，得到具 有随机突变的目的基因片段，再转入酵母，检测其表型。在本工程中，我们对两 种随机突变策略都进行了尝试。 3具体操作3. 1利用易错大肠杆菌F col7 XL1 -red进彳丁随机突变方案 3. 1. 1 XL1-red 简介 XLl-red的三种基本的DNA修复机制缺失，mutS(error-prone mismatch repair), mutD (DNA聚合酶HI 3 - 5核酸外切酶缺失)，mutT (不能水解 8-oxodGTP)被引入了 XLl-red,造成它在复制的过程中容易出各种过失，它的 出错概率是野生型大肠的5000倍左右。相比于野生型，XLl-red生长缓慢，代 时接近野生型的两倍。 3. 1.2主要流程 这可能说明扩增出的质粒是以两种形式存在，当然也有可能是没有本次PCR没有 获得预期产物。具体的结论有待后续进一步检测。 4展望与反思 对于我们本次的创新工程，我们得到的暂时性成果是自主独立构建了 P425 Gal-MCM4的重组质粒，对于易错PCR的条件还在摸索当中摸索，K574T突变的 MCM4重组质粒的构建工作正在进行当中，相信不久就会有结果。很遗憾我们并 没有能够得到MCM4的随机突变并对其进行分析，之后我们将继续对未完成的部 分进行探索。 在最后我们想说，尽管我们没有什么突出的成果，但是我们觉得学院组织这 个创新工程的意义，并不在于让我们取得多么辉煌的结果。结果的有无和好坏并 不是最重要的，最重要的是它给我们提供了一个平台让我们在这样一个过程中去 实践，去探索，去思考，去创新。在整个创新工程的过程中，在感受态的制作和 易错PCR条件的探索上，我们确实遇到了很多困难，但是我们没有想过放弃，也 没想过编造一个结果去应付最后的检查，因为我们坚信无论结果做得怎么样，我 们确实去思考了，去实践了，而且无论如何做科研实事求是最重要的。 积极思考并且不断尝试，在失败中总结经验和教训，实事求是不弄虚作假， 我们一直坚信这些道理，这也是参与本次创新计划给我们最大的收获。 参考文献1、 Alan Greener, Marie Callahan, Bruce Jerpseth An Efficient Random Mutagenesis Technique Using an E, coli Mutator Strain Methods in Molecular Biology, Vol 57 In Vitro Mutagenesis Protocols Edited by M K Trower Humana Press Inc , Totowa, NJ :375-3862、Agilent Technologies 200129-12 Catalog #200129 XLl-Red Competent Cells Instruction Manual 3、Elizabeth 0. McCullum, Berea A.R. Williams, Jinglei Zhang,and John C. Chaput Random Mutagenesis by Error-Prone PCR Jeff Braman (ed.), In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 634:103-110 具体操作步骤 1、易错大肠杆