分光光法检测蛋白质含量.pptxVIP

生物化学与分子生物学实验;实验室规则;实验室安全及防护;实验室常用玻璃仪器;实验考试;实验报告网上提交;实验一;理论 掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造 实验: 利用分光光度技术进行蛋白质含量测定 ; 一、概念 利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术 。 应用：定性、定量 优点：灵敏度高 精确度高 操作简便、快速 ;二、工作原理 物质对光线有选择性吸收作用。 每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质 的浓度成正比。 ;如何定性？ —利用吸收光谱曲线鉴定化合物; 1.朗伯（Lambert）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。 I1/I0=e-K1l 2.比尔（Beer）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。 I1/I0=e-K2C I0 :入射光强度； I :透射光强度；l ：介质厚度 C ：介质浓度; ;4.计算*** （1）标准管法（标准比较法） 实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。 A标准=ε标准C标准L标准 A样品=ε样品C样品L样品 A：吸光度； ε：摩尔吸光度； C：溶液浓度； L：液层厚度; 因标准液和样品液中溶质为同一物质， ε样品= ε标准 因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L样品=L标准 故上二式可写成： A标准/A样品= ε标准C标准L标准/ε样品C样品L样品 C样品=A样品/A标准 × C标准;（2）标准曲线法 绘制标准曲线： 配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法 处理显色，分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标，吸 光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线。 获取样品的浓度：根据测得样品的吸光度值从标准曲线上 获得测定物的浓度。 ;标准曲线使用注意事项;5．应用中注意的问题*** Lambert-beer’s law的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，A宜在之间； 选择波长：最大吸收波长； 参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外所有的成分。; 空白管： 测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。 测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。;分光光度计(spectrophotometer);第21页/共36页; 二 、分光光度计使用步骤（示教） 三、使用时注意事项** 1. 波长选择。 2. 机器预热。 3. 不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光电管疲劳。 4. 不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面。; 5. 比色皿使用注意事项*** 由于紫外光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石英比色皿。 同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度一致）。 比色皿有2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。 ; 比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液体约占全部容积的2/3。 腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中。 每次使用后,应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色皿3～4次。 * 本次实验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。 ;蛋白质定量分析实验; 实验一 双缩脲法测定蛋白质含量;试 剂 （ml）;（二）样品测定： 取样品0.1ml，加生理盐水0.9m1，再加双缩脲试剂4m1，于37℃水浴中放置15分钟，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线并计算得出样品中蛋白质的浓度。 注意： ;【基本原理】 考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质可通过范德华力结合，与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成595nm，能过测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 优点：灵敏度高，1-5μg；测定速度快；干扰物质少。 ; 1．取试管3支，编号按下表