细菌基因组dna提取及分光光度法定量.docVIP

细菌基因组DNA提取及分光光度法定量 一、目的 1. 熟识并把握SDS裂解法提取细菌基因组DNA的基本方法。 2. 了解基因组DNA的分光光度法定量及荧光检测。 二、原理 基因工程试验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA非易事。细菌基因组是环状DNA，在抽提过程中，不行避开的机械剪切力必将切断DNA。因此要尽可能地温柔操作，削减剪切力，削减切断DNA分子的可能性；分子热运动也会削减所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。此外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。在提取过程中EDTA的作用就是螯合二价金属离子，起到抑制核酸酶活性的作用。 制备的细菌染色体DNA 必需是高纯度的，以满意基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必需没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。大肠杆菌染色体DNA抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）及CTAB裂开细胞，SDS具有的主要功能是：(1)溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消退染色体DNA上的蛋白质；(3)SDS 能与蛋白质结合成为R1-O-SO3R2-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来