细胞转染与筛选.docVIP

细胞转染与筛选方法总结 细胞转染：对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后，细胞计数，接种于六孔板，每孔种植2×105个细胞，加2ml/孔完全培育基培育过夜，弃去培育基，PBS洗3次，加入2ml/孔OPTI-MEM培育基。将3μl FUGENE HD加入94μl空白OPTI-MEM培育基中，混匀，室温放置5min，加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2μg，混匀，室温放置10min，加入六孔板中。六小时后，将细胞培育基换成DMEM完全培育基。 细胞筛选：转染后36h, 荧光显微镜下观看细胞转染状况，48h后加入G418，其终浓度为1000μg/ml。放入细胞培育箱 连续培育，每两天换液，重新加入G418。待正常组细胞全部死亡（约15d）将G418浓度调整至500μg/ml，连续培育2周后，长出抗性克隆，挑取单个克隆，在96孔板中扩增，培育2周后，单个克隆已经长满整个孔，将细胞消化后转入6孔板，使用完全培育基连续培育，继而进行其他指标的检测。 细胞转染操作方法 转染 ，是将外源性基因导入细胞内的一种特地技术。随着基因与蛋白功能讨论的深化，转染目前已成为试验室工作中常常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法许多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法