一种快速鉴定RNA 质量的方法.docxVIP

随着分子生物学技术的迅猛发展及在医学领域中的普及,以 RNA 为研究对象的实验与日俱增。RNA 质量的好坏直接关系到后续实验的成败。 随着分子生物学技术的迅猛发展及在医学领域中的普及,以 RNA 为研究对象的实验与日俱增。RNA 质量的 好坏直接关系到后续实验的成败。Northern 印迹杂交分析、寡聚(Oligdt) 纤维素选择分离 mRNA、cDNA 合 成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上取决于 RNA 的质量。 关键词： RNA 质量 identifyinggualitytotalRNANorthern 印迹 mRNAcDNA 合成 曹廷兵,叶治家,巩 燕,彭家和 (第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室, 400038 重庆) 提 要: 目的 建立一种快速鉴定 RNA 完整性的方法。方法 在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上,结合甲醛变性琼脂糖凝胶电泳加以改进而成。 结果 提取的总 RNA 用此方法电泳后可得到 28S、18S、5. 8S(5S) 三条清晰的 rRNA 条带。 结论 此方法可以达到对 RNA 完整性进行快速鉴定的目的。 随着分子生物学技术的迅猛发展及在医学领域中的普及,以 RNA 为研究对象的实验与日俱增。RNA 质量的好坏直接关系到后续实验的成败。Northern 印迹杂交分析、寡聚(Oligd t) 纤维素选择分离 mRNA、cDNA 合成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上取决于 RNA 的质量。因此在进行这些实验之前对 RNA 的质量进行快速可靠的鉴定就十分必要。目前RNA 的质量采用变性琼脂糖凝胶电泳方法来鉴定[1 ] ,这些方法步骤繁琐、费时、费力。我室在长期进行 RNA 的研究中,摸索出了一套稳定、快速和可靠的鉴定 RNA 质量的方法,现报道如下。 材料与方法 1. 1 主要试剂 提取 RNA 的 TriPure Isolation Reagent 试剂盒、DEPC 等购自 B.M 公司,常规试剂如琼脂糖等为进口或国产 AR 级以上。 1. 2 RNA 的提取 以人胎盘组织提取总 RNA ,方法按 TriPure Isolation Reagent 试剂盒说明书进行。对提取的RNA 在紫外分光光度计上测A260 值和A260/ A280 比值,确定所提取RNA 的浓度和纯度。 1. 3 RNA 的琼脂糖凝胶电泳 电泳方法、步骤大体同文献[ 2 ]中的琼脂糖凝胶电泳。为最大限度降低 RNA 在电泳时被降解,结合甲醛变性琼脂凝胶电泳分离 RNA 方法[1 ] ,在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上进行如下改进。①电泳RNA 所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用肥皂粉洗干净后用双蒸水冲洗二遍后在室温晾干备用。②用新的 1XTBE 配制 1. 2 %琼脂糖凝胶,倒胶时溴化乙锭(EB)直接加入凝胶中。③制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的 1X TBE ,液面只能刚好同胶面平齐,缓冲液不要淹过胶面。④点样时,样品 RNA 每 10μl 加入 2 μl 上样缓冲液,上样缓冲液是用 DEPC 处理的水配制的 50 %甘油,另外单独点一样品孔含有 3μl 溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂,电泳电压 4 V/ cm ,电泳时间 2 h 左右便可取出凝胶在紫外灯下观看所提取的 RNA 的质量或进行拍照记录。 结果 取人胎盘组织 RNA 3μg 和 6μg ,按本方法以 1. 2 %的琼脂糖凝胶进行电泳,可见 28 S、18S、5. 8S(5S) 三条清晰的 rRNA 条带。电泳结果见图 1。 讨论 RNA 作为分子生物学的主要研究对象之一,但它极易受到 RNase 的水解,在进行 RNA 操作时主要是避免外源 RNase 的污染,特别是在得到 RNA 沉淀以后,无 RNase 抑制剂存在的条件下尤其如此。因此, 在 RNA 操作过程中必须对所有实验材料进行彻底的处理,灭活RNase ,如 EP 管、Tip 头等;另外,有一个良好的操作环境也是非常的重要。 RNA 质量如何、是否被降解通常采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳方法来鉴定。此电泳的主要目的之一是为了Northern blot 之用。但在RNA 的其他用途中,如cDNA 合成和寡聚(O ligdT) 纤维素选择分离 mRNA 等实验中要对 RNA 进行质量鉴定,此方法就现得繁琐、费时、费力,而用常规琼脂糖凝胶电泳 RNA 会水解而达不到鉴定的目的,如果用本研究改进的 1. 2 %琼脂糖凝胶方法电泳鉴定,简单、高效、经济实用,并且能达到同用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳相同的实验结果。因此本方法在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上所作的每一项改进均是为了避免 RNA 在电泳过程中被水解,比如对所有电泳器具彻底的清洗处理就是为了尽量清除器具上存在的 RN