电镜实用11次学习.pptxVIP

一、SEM生物样品制备的基本要求 二、SEM生物样品制备的基本方法 三、SEM生物样品的制备与观察 ;生物样品的特点; 每一操作过程，都应注意防止对样品的污染和 损伤，使被观察的样品尽可能地保持原有的外 貌及微细结构。 去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防 止对镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要 尽量减少和避免样品体积变小及收缩变形等人 工损伤。 降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能， 以提高二次电子发射率，建立适当的反差和减 少样品的充放电效应。 无论是观察组织细胞的表面或内部微细构造， 都应注意确认和保护样品的观察面。;; 取材即选取观察材料。 基本要求： 动作迅速，部位准确 切取材料的切刀应锋利 材料尺寸不宜过大，在满足观察要求的前提下，越 小越好，样品厚度在几毫米之内即可 采取易分散的材料（花粉、孢子）一类时，要注意防 尘，避免样品飞散造成混杂 观察游离细胞等混在液体中的试材时,数量必须取够， 避免后续处理时由于丢失造成材料不足而影响观察， 这类材料取出后即应不间断地进行后续处理;2.清洗;例如： 带土壤的植物根应先取材后清洗； 研究不同条件下叶表气孔开闭状态时，则应提前清 洗叶表，叶片在植株上时先予以固定，然后再取材， 或者不清洗，活体固定后立即取材； 动物脏器表面含有较多粘液，使用含酶的清洗液效 果较好； 附着在微小样品(如昆虫触觉)的微细粉尘，最好用 超声波清洗； 清洗游离细胞则必须使用条件相应的缓冲液； 有些样品表面有油脂、蜡质等，观察前应该用相应 的溶剂处理，处理时要注意防止溶剂对样品的损伤。;贴附于组织表面的 细小的样品 表面覆盖大量粘液的样品;组织培养细胞 某些特殊样品 例如乳腺组织，因其含有多种蛋白质与脂类为主要成分 的乳汁，所以需分别用16%甘油和20%乙醇浸泡处理，才能清 洗干净。 一般样品固定后的清洗 但在制样过程中，每更换一次试剂，为了消除可能出现 于样品表面的反应沉淀物，均需用双重蒸馏水进行充分清洗。;比较??净的组织--固定后清洗 具体方法:将样品放入干燥的玻璃小瓶内，倒入足够量的清洗液 (最少为样品体积的20倍)，按一定方向轻轻摇动小瓶， 更换3次新清洗液，以达到充分清洗的目的。 表面覆盖大量粘液和杂质的样品--固定前清洗 对一些粘着杂质多而紧密的样品，可利用振荡器进行清洗 或用注射器(或喷射瓶)加压冲洗。清洗所用的时间，可根据样 品附着物的情况而定。 游离细胞、微生物及其他微小生物样品--离心清洗法 具体步骤:将固定后的样品放入离心管内，注入与固定液相应的 缓冲液或用磷酸缓冲液配制的20%NaCl缓冲盐溶液 lOml，摇匀或轻轻搅匀后，4000转/分的转速下离心 3~5分钟，弃去上清液，再注入缓冲液或缓冲盐溶液 10m1，按上述条件重复离心3次即可。;表面形态结构复杂、皱折凹陷多而又嵌有细小杂质不易 清洗的样品--超声清洗法 在超声清洗时，应根据样品大小及污染程度，严格控制其频 率和功率的强弱，谨防因强度过大或超声时间过长而引起的样品 破碎变形。 为避免取材后血液对组织结构的污染，尤以组织细胞内 部结构为主要观察对象时--灌流清洗法 操作步骤:选一较粗大的动脉如腹主动脉及颈动脉等，按常规插 入塑料导管加以固定，另在右心房剪一小口，以备引出 血液和清洗液而后用注射器或输液器，向导管灌注缓冲 液或0.09%生理盐水，冲洗组织器官内的血液，至内脏 血色消失或流出液基本不带血色为止。随即取材、固定， 或先固定后再取材精修。为了避免灌流压力过大造成组 织损伤，最好采用可以控制灌流压力的冲洗器进行灌洗。;在选择清洗液时，要使其ph值、渗透压及清洗液的温 度，尽量符合组织细胞处于活体状态时的生理条件， 以免引起样品的收缩或膨胀变形及其他人工损伤性变 化。 往容器内添加和更换清洗液时，应沿瓶壁缓缓滴加， 移动样品时，要采用牙签贴附法，以避免强力冲击和 夹持样品可能出现的损伤。需用喷射、超声或作用较 强的溶剂清洗样品时，要严格控制强度和时间，密切 观察样品的变化。 在清洗换液过程中，应把时间安排紧凑，使样品始终 保持湿润，严防发生空气干扰，造成标本的皱