《蛋白质的测定》.ppt

整理课件 蛋白质的测定 蛋白质的组成及方法简介: 乳中的蛋白质约占乳成分的3-4%，在体内可以产生热能，乳中的蛋白质可分为酪蛋白与乳清蛋白，将牛乳加酸调到PH4.6（20℃）的等电点所沉淀的蛋白质为酪蛋白，而乳清蛋白质残留在溶液中。 组成：蛋白质主要由C .H .O.N.S.组成。 方法：凯氏定氮仪常量检测法 ※ 半微量凯氏定氮法 实验原理 : 1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4 反应式为： H2SO4==SO2+H2O+[O] R. CH.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3 R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O 2NH3+H2SO4==(NH4)2SO4 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。 反应式为: 2NH4++OH-==NH3+H2O NH3+H3BO3==NH4++H2BO3- 3. 再用已知浓度的硫酸标准溶液滴定，根据硫酸消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。 实验试剂： H2SO4标准溶液（0.1 mol/L ） ； H3BO3溶液(3%)； H2SO4(浓)； NaOH溶液(30-40%)； K2SO4(固体)； CuSO4(固体)； 甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。 实验仪器： 凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、 蒸馏单元及电位滴定仪； 消化管，适用于凯氏定氮仪； 接收瓶，300ml三角瓶或烧杯。 消化炉 蒸馏单元及电位滴定仪 实验步骤： 1、样品的称取： 原料奶和纯牛奶：称取约5g； 乳饮料：称取约8g； 冰激凌：称取约5g； 乳粉：称取约0.5g； 将上述样品用减量法称入消化管中。 2、消化： 将样品称入消化管中，同时称取5g硫酸钾，0.5g硫酸铜然后加入15~20ml浓硫酸，将消化管放入消化炉中，将温度旋钮设定在大约6档左右，连接好排气装置并打开开关，开始进行消化。 注：决定一个精确的沸腾时间必须根据在一个特定的实验室用仪器测量一个特定的样品所得到大量数据，一般选择一个高蛋白，高脂肪的牛奶样品，在透明后用不同的沸腾时间（1-1.5h）测定它的蛋白含量。蛋白平均含量随沸腾时间增加而增加，逐渐趋于恒定，然后当沸腾时间更长含量反而降低。选定能得到最大蛋白质的沸腾时间。 3、蒸馏： 把装有消化液的消化管放到蒸馏单元中，在冷凝器出口的下面放置一个接收瓶，还要把连接管放到接收瓶底端，编辑蒸馏程序，设定硼酸50ml，氢氧化钠65ml，蒸馏时间3—5min。 注：蒸馏时间的确定※ 4、滴定： 用pH为7.00和4.00的缓冲溶液校准电位滴定仪。 设定电位滴定仪的滴定和结果计算程序，将滴定终点设为PH值4.60，并开始滴定。 空白试验： 按照上述步骤进行空白试验，在消化管中加入0.85g蔗糖。 5、结果表达 ： （V-V0）×c (H+)×0.014 氮含量（％)＝ ×100 m 其中： V ——测定中消耗盐酸标准容液的体积，ml。 V0—— 空白试验中消耗盐酸标准容液的体积，ml。 c (H+) ——硫酸标准溶液H+的摩尔浓度，mol/L。 m——样品质量，g。 四舍六入的结果保留到0.01%。 蛋白质含量的计算，用质量百分数表达，用氮含量乘以6.38即可。（6.38的含意) 6、回收试验： 方法的准确性应定期通过下面的回收试验进行检查，按照上述步骤进行， 用0.12g硫酸铵（烘至恒重）加0.85g蔗糖进行测定。回收率应大于99％。 用0.18g色氨酸或0.16g盐酸赖氨酸，加0.67g蔗糖进行测定。回收率应大于98％。 回收率的计算： 用氮含量除以硫酸铵的理论氮含量21.19％即可。 注意事项 ： 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 样品中脂肪或糖含量较高时，消化过程中易产生大量的泡沫，可加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 有机物完全分解，消化液呈兰色或浅绿色，但含铁量多时，呈