体内药物分析方法及方法的设计与评价.pptVIP

(2)生物样品的处理 ①血浆：取样品0.1mL置10 mL离心管中，加入乙酸乙酯3.5mL，振荡3min，离心(2000 r/min，5min)，移取上清液，于50℃水浴用氮气吹干，残渣加内标液100uL，振荡溶解后进样20uL。 第62页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 ②粪和尿：大鼠粪便样品于室温风干称重后，置乳钵内研成细末，用生理盐水按10％稀释使其成混悬液。取混悬液0.5mL或尿样0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取两次，合并两次提取液，于50℃水浴用氮气吹干，加入甲醇1.0 mL，振荡溶解后进样10 uL。 第63页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 1．绝对回收率 绝对回收率也称萃取回收率、提取回收率，它反映了一个方法的萃取效率，与体内样品检测灵敏度有关，是评价体内药物分析方法的重要指标之一。 现以色谱法为例，说明绝对回收率的求算过程。 第30页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 例如取一定量被测药物标准品，加到空白血样中，按规定方法处理，使最后溶液中药物标准品浓度为1ug/mL，测定色谱峰面积，记为A测，另取1ug/mL的药物标准品的纯溶剂溶液宜接进样，测得色谱峰面积记为A真，用外标法计算。 第31页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 绝对回收率应考察高、中、低3个浓度，低浓度选择在定量限(LOQ)附近，高浓度在标准曲线的上限附近，中间选一个浓度。对于回收率的大小与变异不宜苛求，一般添加量在10-6～10-9级，绝对回收率若能达到50％～80％，应认为是令人满意的。 第32页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 在色谱分析中常采用内标法测定含量，将药物标准品和内标准物质加到空白血样中，按规定方法处理，测得药物和内标峰面积，求出它们的比值R测＝A药/A内。另取相同浓度的药物标准品和内标准物质的纯溶剂溶液进样，得药物标准品和内标峰面积，计算两者的比值R真＝A药/A内。再根据下式求出回收率： 第33页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 在内标法中，应注意药物与内标准物质各自用外标法测得的绝对回收率应相近，两者相差应小于10％，否则回收率偏离100％太远。 第34页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 2．方法回收率 取一系列浓度的药物标准品加到空白体液中，按设定方法测定，根据标准品浓度及响应的测定信号值绘制标准曲线，先按最小二乘法求出回归方程。然后取高、中、低浓度的药物标准品添加到空白体液中，每个浓度至少平行测定5份，按标准曲线制备方法同法测定，所得信号值代入回归方程，求得测定值。最后与加入量比较，得方法回收率。除定量限外，各浓度点测得的平均值偏离实际加入量应小于15％，定量限这一点应小于20％。 第35页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 在测定回收率时，不管采用何种方法，都要注意以下几个问题： ①添加的药物量必须与实际测定量相近； ②添加物质必须与实际存在的状态相似； ③必须同时做空白试验。 第36页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 上述①、 ②两点的原因： 一是如果添加量大，实际测定量小，那么有可能测定量在回收率的误差范围内，这样就不可靠； 二是如果添加量大，蛋白质实际结合能力小，这样存在在空白血样中的添加药物部分没有结合，与实际存在的情况不符，测得回收率容易偏高。 因此在报道一个方法的回收率时，必须说明添加量。 第37页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 方法的准确度有时也可用一个已证明有相当专属性和可靠性的方法与新建立的方法同时进行测定，然后比较两法测得结果的相关程度。用相关系数r来表示，一般要求r＞0.95，直线的斜率接近1，表明两法吻合。 第38页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 (二)精密度 精密度(precision)是表示一组测量值彼此符合的程度。有多种表示方法，在体内药物分析中常用的表示方法有： 第39页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 精密度测定通常采用高、中、低三种浓度进行测定。低浓度选择在定量限(LOQ)附近，高浓度在标准曲线的上限附近，中间选一个浓度。每个浓度平行测定5～7次，计算测定结果的标准差。除定量限外，各浓度点的RSD不应大于15％，最低定量限这一点不应大于20％。 精密度可进一步分为日内或批内精密度和日间或批间精密度。前者表示一次测定的重复性，后者表示不同时间测定结果的重复性。 第40页，共89页，2022年，5月20日，16点12分，星期一 日内(或批内)精密度是考察分析方法在短期内测定方法的变异情