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实验十一 地西泮注射液的含量测定 [高效液相色谱法] 一、实验目的 掌握高效液相色谱外标法测定药物的基本原理、操作及注意事项。 二、主要仪器和试药 甲醇、萘、地西泮注射液（2ml:10mg ）、地西泮对照品、乙腈、异丙醇、 Agilent 1100 –HPLC 色谱仪、紫外检测器、C8 柱、超声波振荡器、0.45 微孔滤 膜、微量进样器（50 μl ）、10ml 容量瓶（4 个）、1ml 吸量管（3 支） 三、实验准备 1. 1mg/ml 地西泮溶液：取地西泮对照品约25mg，精密称定，置25ml 容量瓶中， 加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀。 2. 2mg/ml 萘溶液：精密称取萘 50mg，置 25ml 容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻 度，摇匀，即得 2mg/ml 萘溶液。 3. 乙腈-水（70 ：30 ） 三、实验方法 （一） 色谱条件 色谱柱：C8 柱 流动相：乙腈－水（70:30 ） 柱温：室温，流速：1.0ml/min，检测波长：254nm （二）内标液和对照品溶液的制备 1. 对照液（1）：精密量取 1mg/ml 地西泮溶液 1ml，用甲醇稀释至 10ml，作为 外标法用对照液（1）。 2. 对照液（2 ）：精密量取1mg/ml 地西泮溶液和 2mg/ml 萘溶液各 1ml，同法稀 释至 10ml，作为内标法用对照液（2 ）。 （三）供试液的制备 取本品适量（相当于地西泮 1mg），两份，分置 10ml 容量瓶中，一份加甲 醇定容至刻度，作为供试液 （1）；另一份加入萘溶液 1ml，再加甲醇定容至刻度， 作为供试液（2 ）。 （四）测定法 取对照液（1）供试液（1）各20µl 注入液相色谱仪，记录色谱图，得峰面 积，按外标法定量计算；另取对照液（2 ）供试液（2 ）各20µl 注入液相色谱仪， 记录色谱图，得峰面积，按内标法定量计算；比较外标法与内标法定量测定的结 果。 四、注意事项 1. 高效液相色谱法的流动相在不同的仪器上使用时得到的色谱图略有差 异。因此上述方法规定的流动相可能需要调整。 2. 超声波提取过程中时常有发热现象，因此，宜加入少许冰块。 3. 对于色谱手动进样系统，应注意六通阀的进样原理，为保证定量的准确， 进样量应为定量环体积的2～3 倍。 4. HPLC 测定中流动相使用前必须经过滤膜过滤和超声脱气。 5. HPLC 测定完毕后，必须用水冲洗系统30 分钟以上，然后再用甲醇冲洗。 更换流动相时必须先停泵，待压力降至零时，将滤头提出液面，置另一流动相溶 液中。 五、计算 1.外标法定量：含量（Cx ）= （Ax /A ）×C R R 式中A 为对照品的峰面积值； C 为对照品的浓度； R R Ax为供试样品的峰面积 2. 内标法定量：校正因子f = (As/ Cs)/ (A / C ) R R 含量（Cx ）= f ×Ax / (A s ＇/ Cs) 式中A 为对照品的峰面积值； C 为对照品的浓度； R R As为加对照品中加入内标物的峰面积值； Cs为加入内标物的浓度； Ax为供试样品（2 ）的峰面积值； As ＇为测试样品时加入的内标物的峰面积 值。 3. 每ml含量 标示量% = ×100％ 标示量 1 ＝C ×稀释倍数× ×