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“祸从口入”---食品添加剂苯甲酸可以酰化修饰组蛋白 编者按 苯甲酸钠是常见的食品添加剂，在蜜饯、果干、汽水中广泛使用。此外苯甲酸钠也是FDA批准的药物，用于治疗尿素循环紊乱导致的高血氨症。虽然苯甲酸钠被认为是相当安全的食品添加剂，但是近期也有其对健康不利的报道。同时，日本现在已经对苯甲酸钠的使用作出限制，但是对于苯甲酸钠影响健康的分子机制还未知。 近日，芝加哥大学赵英明教授课题组在国际著名期刊Nature?Communication上发表了题为“Lysine benzoylation is a histone mark regulated by SIRT2”的论文，报道了迄今唯一的发生在组蛋白赖氨酸上，含有苯环的酰化修饰----苯甲酰化修饰（图1），为蛋白质的翻译后修饰研究开辟新的领域，也为评价目前食品添加剂的安全性提供了新思路。赵英明教授课题组的黄河博士为文章的第一作者，参与本研究的还有香港大学的郝权教授、乔治亚大学Y.?George?Zhen教授。 图1. 苯甲酰化与乙酰化的比较 研究小结 苯甲酸钠是被广泛使用的食品添加剂，FDA允许在食品中不高于0.1%的添加量，同时苯甲酸钠也被作为治疗高血氨症的药物。有报道指出，摄入苯甲酸钠可能会对人的健康产生伤害，用于治疗目的的苯甲酸钠若剂量不合适也会导致健康问题，但是对于苯甲酸钠影响人类健康的分子机制的研究并不明朗。 近日赵英明教授发现了发生在赖氨酸上的新型修饰-----苯甲酰化修饰，运用生物质谱与生物化学的方法鉴定出位于组蛋白的22个赖氨酸可发生苯甲酰化修饰，该种修饰会受到苯甲酸钠的激发，并受到SIRT2的调节。CHIP-Seq和RNA-Seq数据揭示出苯甲酰修饰主要集中在基因的启动子上，且其生理功能与乙酰化并非完全相同，会通过影响基因表达水平调控响应的通路。 研究思路和成果 1.?组蛋白上赖氨酸苯甲酰化修饰的鉴定和验证 作者提取了HepG2细胞的蛋白，进行胰蛋白酶酶解后，利用高效液相色谱-质谱联用，得到质谱数据（图2上）后，利用赵英明教授搭建的曾为无数翻译后修饰的发现立下汗马功劳的PTMap（Proc Natl Acad Sci U S A.?2009 Jan 20;106(3):761-6.）分析数据，在H2B的第五位赖氨酸上发现了一个104.0268道尔顿的质量偏移，并通过人工合成肽段，比较HPLC的保留时间和质谱谱图，确定这个质量偏移是由一个苯甲酰基引起的。 图2. （上）H2B第五位赖氨酸苯甲酰化的质谱鉴定及 （下）苯甲酰化泛抗体的质控 为了更好的研究苯甲酰化修饰，作者利用杭州景杰开发针对苯甲酰化修饰的泛抗体进行检测。检测结果显示，该抗体可以非常灵敏的检测到苯甲酰化修饰，而不会对赖氨酸上的其他种类的修饰产生非特异性结合（图2下）。 2.?苯甲酰化位点的鉴定 后续的研究中，通过检测5mM苯甲酸钠处理的细胞与对照组的差异，作者鉴定到了共计22个组蛋白的苯甲酰化修饰位点（图3）。令人振奋的是，几乎所有的苯甲酰化修饰位点都集中在组蛋白的N末端区域的赖氨酸侧链，这与广泛分布在组蛋白的赖氨酸的乙酰化、巴豆酰化产生了强烈对比，暗示了苯甲酰化在染色质的调控中可能扮演了与众不同的重要角色。 图3. 组蛋白上的苯甲酰化位点分布 3.?苯甲酸钠刺激条件下苯甲酰化修饰的动态调控 利用同位素氘标记的方法，作者确认了苯甲酸钠确实可以刺激细胞中苯甲酰化的发生，而同时细胞的乙酰化水平仅仅略有降低（图4）。作者同时指出，一些位点的苯甲酰化水平与乙酰化水平相当，显示出在暴露在富含苯甲酸钠的环境中，苯甲酰化的发生是非常普遍的。 图4. 苯甲酰化水平受到苯甲酸钠浓度低影响 4.?SITR2可以在体内体外去除苯甲酰化修饰 HDAC，组蛋白去乙酰化酶是一类可以将乙酰基团从组蛋白上移除的一类酶。其中一种HDAC，SIRT2被鉴定出具有明显的去苯甲酰化酶活性（图5左上），并且催化过程依赖于NAD+，且可以被第三类HDAC抑制剂（例如NAM）抑制其催化活性，而不受TSA的影响（图5右上）。作者还进一步比较了SIRT2的去乙酰化和去苯甲酰化酶活性的区别（图5下）。 图5. SIRT2依赖于NAD+的去苯甲酰化修饰酶活性 5.?苯甲酰化修饰的全基因组分布 为了研究组蛋白苯甲酰化修饰在全基因组的分布情况，作者在苯甲酸钠处理后的细胞中利用CHIP-Seq的方法鉴定到了20283个发生苯甲酰化修饰的位点，其中超过半（57.33%）的苯甲酰化修饰发生在基因的启动子中（图6 左上）。类似于赖氨酸的乙酰化，苯甲酰化修饰较少发生在TSS区域，而较多地发生在TSS的上下游（图6 上中），预示着苯甲酰化在转录调控中扮演的重要作用，而作者对CHIP-Seq数据与基因表达水平的相关性分析支持了这一猜想（图6 右上）。 图6. 苯甲酰化在基因组