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荧光池 I0 I If荧光强度 检测器 四、荧光强度与荧光物质浓度的关系 强度为I0的入射光，照射到浓度很稀的荧光物质时,产生荧光，荧光强度If 与入射光强度有下面的关系： If = ?f Ia= ?f （I0 - I ） Ia为吸收的辐射强度 I0为入射光强度 I 为透射光 If = ?f （I0- I010-A ） = ?f I0 （1-10-A ） I = I010-A 第三十一页，共六十一页，2022年，8月28日 当A﹤0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化 If = 2.3 ?f I0A =2.3 ?f I0?bc 将上式展开 第三十二页，共六十一页，2022年，8月28日 当A﹤0.05时， If与 ?f 、I0、 ?和c 有关。对一给定物质，当激发光波长和强度一定时， ?f 、I0、 ?和b为常数，合并为K If = KC Ip = KC 定量分析依据 第三十三页，共六十一页，2022年，8月28日 荧光强度与物质浓度呈线形关系， If=KC 只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高 浓度高时， If与C不呈线形关系， 有时C增大， If反而降低。因为公式[ ]中后面影响；有时发生荧光猝灭效应 第三十四页，共六十一页，2022年，8月28日 荧光猝灭 ——荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降(荧光效率?f 下降)称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂 第三十五页，共六十一页，2022年，8月28日 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂 碰撞猝灭—— M +?激 → M* M* + Q → M + Q +热 自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象 第三十六页，共六十一页，2022年，8月28日 （一）荧光分析仪器 ——主要由光源、单色器、样品池、检测器和显示器组成。 五、荧光和磷光分析仪器 第三十七页，共六十一页，2022年，8月28日 光源 第一单色器 液池 检测器 第二单色器 检测器 放大器及记录器 ex ? em 与分光光度计有两点不同 ①两个单色器 ②检测器与激发光互成直角 I0 I 第三十八页，共六十一页，2022年，8月28日 1、光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽 荧光计中，常使用卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯 应用最广泛的一种光 源，可发射250~800nm 很强的连续光源 利用汞蒸气放电发光的 光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线 以365 nm 的谱线最强 第三十九页，共六十一页，2022年，8月28日 2、单色器 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱 第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长? ex 第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长? em。 第四十页，共六十一页，2022年，8月28日 3、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边 4、检测器 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可 大大提高荧光强度 5、读出装置 扫描激发光谱和发射光谱记录, 结果打印输出 第四十一页，共六十一页，2022年，8月28日 （二）激发光谱和荧光、磷光光谱 激发光谱：荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定 I ? ex 固定?em 荧光波长 获得方法：固定?em不变，改变?ex，测定它的荧光强度，以I 为纵坐标， ?ex为横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱，确定最大?ex 第四十二页，共六十一页，2022年，8月28日 I ? em 固定? ex 激发光波长 获得方法：固定?ex不变，改变?em，以I 为纵坐标， ?em为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱 从曲线上找出最大的 ?em 发射光谱：荧光、磷光光谱 第四十三页，共六十一页，2022年，8月28日 关于仪器分析分子发光分析法 第一页，共六十一页，2022年，8月28