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会计学
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TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成
TUNEL
TUNEL的原理
TUNEL的操作步骤
结果及注意事项
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主要试剂
1. 缓冲液(Labeling Buffer)：
用于维持一定的反应条件，含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾、 pH7.2 10mmol/L CoCl2 (氯化钴)、1mmol/L DTT(二硫苏糖醇)。
2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT) ：
催化3’-OH末端 dUTP反应的关键酶
3.荧光素-dUTP ：
TdT的底物和本实验的标记物
4.蛋白酶K：
消化组织，增加细胞通透性
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凋亡细胞的特征是:内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的 3’-OH末端 。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)能将脱氧核糖核苷酸连接到DNA的3’-末端。
TUNEL的原理是：用荧光素（fluorescein）标记的脱氧核糖核苷酸，在TdT 的作用下连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，用荧光显微镜即可观察结果。在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗体，可进一步放大检测信号，并且普通显微镜观察实验结果。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
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TUNEL原理
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标本处理
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实验步骤
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实验流程
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结果
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注意事项
极少数细胞凋亡时没有DNA断裂或DNA裂解不完全，此时不适用TUNEL法检测，进而产生假阴性结果。
在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，
从而引起假阳性结果。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标
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