猕猴桃花粉溃疡病活菌检测技术规程.pdfVIP

DB6111/T 149—2020 猕猴桃花粉溃疡病菌活菌检测技术规程 1 范围 本文件规定了猕猴桃花粉中活性溃疡病菌 （Pseudomonas syringaepv.Actinidiae，Psa）检测方 法的原理、检测方法、检测样品与菌株保存、结果记录与资料保存的要求和内容。 本文件适用于活性溃疡病菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 23621-2009 农业植物检疫实验室基础条件 SN/T 0168-2015 进出口食品中菌落总数计数方法 SN/T 0800.1-2016 进出口粮油、饲料检验 抽样和制样方法 3 原理 猕猴桃为雌雄异株植物，雌雄株之间必须通过授粉才能坐果，花粉中可以携带活性溃疡病菌。本文 件利用常规生物学鉴定方法和菌落PCR检测方法对花粉中溃疡病菌进行检测，为阻止猕猴桃细菌性溃疡 病菌的传播提供技术支撑。 4 检测方法 4.1 实验室要求 猕猴桃细菌性溃疡病菌检测所用实验室的设置与管理符合GB/T 23621—2009要求。除另有规定外， 本标准中的所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB 6682中一级水的规格。病原菌培养及 鉴定所需试剂见附录B。 4.2 检验程序及鉴定方法 猕猴桃花粉Psa活菌检验程序见图1。 4.2.1 操作步骤 4.2.1.1 检测样品抽取 见SN/T 0800.1-2016。 4.2.1.2 抽样数量 1 DB6111/T 149—2020 10瓶 （件）以下，逐瓶抽取，10瓶～100瓶，随机选10瓶抽取样品；100瓶以上，按照一批花粉总瓶 数的平方根数抽取，见公式 （1）。每瓶 （件）抽取2 g花粉。 (1) 式中： N—一批花粉总瓶(件)数。 n—应抽取瓶 （件）数 （取整数，小数部分向上约）。 检 样 稀 释 平板接种 总菌落计数 PCR 确认试验 检测报告 图1 猕猴桃花粉Psa活菌检验程序 4.2.2 抽样方法 无菌条件下将装花粉的容器充分震荡，使容器内花粉充分混匀；容器表面用75%乙醇在包装口擦拭 消毒，待10 min～15 min后，用无菌药匙取2 g花粉于无菌的10 mL离心管中，每瓶 （件）花粉需换用1 把药匙。-20 ℃～40 ℃保存备用。 4.2.3 样品制备 4.2.3.1 制备样品匀液 无菌操作称取1 g样品，加入装有9 mL的灭菌双蒸水的和适量玻璃珠的50 mL稀释瓶中，迅速振摇， 将样品混匀，制成1:10的样品匀浆液。振摇时振幅为30cm，7s内振摇25次，也可以用机械振荡器振荡 15 s代替手摇。 4.2.3.2 稀释样品匀液 -2 -3 -4 无菌条件下取样品匀液1 mL加到9 mL稀释剂中，并以此类推，分别制成10 、10 、10 连续稀释度 或其它合适稀释度的样品匀液。 4.2.4 选择性培养基平板接种和培养 2