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免疫组织化学检验技术会计学第1页/共65页第二十二章 免疫组织化学检验技术第2页/共65页免疫组织化学检验技术又称免疫细胞化学检验技术 ---是利用标记的特异性抗体（或抗原）与组织细胞内抗原（或抗体）进行的抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织和细胞抗原进行定性、定位、定量测定的免疫检测方法。 第3页/共65页免疫组化的检测原理第4页/共65页免疫组化的检测原理第5页/共65页免疫组化的检测原理第6页/共65页第一节免疫组化检验技术基本知识第7页/共65页免疫组化全过程第8页/共65页一、标本制作 标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分析的保障，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确显示和定位。 （一）标本的主要来源 主要有： ①活体组织 ②各种体液及穿刺液 ③培养细胞等 第9页/共65页（二）标本的固定与保存 1．组织材料的固定目的 ①防止组织细胞的死后变化，以保持其固有形态 ②使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构 ③使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，以便染色后易于鉴别和观察 ④固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，便于制片 ⑤防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构 ⑥经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。第10页/共65页 2．固定剂的选择 最佳固定剂的标准 ①最好地保持细胞和组织的形态结构 ②最大限度地保存抗原的免疫活性 3．固定方法 固定方法常用 ①浸泡法—主要适用于活检和手术标本以及其它不能进行灌注的组织固定。 ②灌注法—适用于动物实验研究。第11页/共65页第12页/共65页（三）玻片的处理 玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤之一 一般用免疫组织化学的载玻片均需涂一定的黏合剂，常用的切片黏合剂有树脂胶、多聚赖氨酸和防脱片剂（四）切片方法的选择第13页/共65页第14页/共65页二、抗原处理（一）进行抗原的暴露和修复的原因 1.固定液的影响 2.抗体制备的影响 （二）抗原的暴露 主要采用酶消化的方法 在选择酶消化时，应针对要显示的不同的抗原成分而选用不同的酶 在日常工作中用胰蛋白酶消化即可 第15页/共65页（三）热诱导的抗原修复 抗原修复是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复以提高抗原抗体的阳性检出率 微波处理法水浴锅法压力锅法第16页/共65页三、抗体处理抗体是免疫组织化学技术的首要试剂 （一）抗体的选择 具有高度特异性和稳定性的优质抗体 （二）抗体的稀释 抗原抗体反应须有适当的比例，过量或不足均不能达到预期结果 （三）抗体的合理保存 要特别注意保持抗体的生物活性 第17页/共65页四、常用标记物（一）荧光素 如：异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明等（二）酶 如：辣根过氧化物酶(HRP) （三）生物素-亲和素系统（四）免疫金标记技术（五）免疫铁蛋白技术第18页/共65页五、免疫组织化学技术的结果判断（一）对照染色设计 为了保证免疫组织化学染色的准确性，证明和肯定阳性结果的特异性，排除某些非特异性染色，通常需针对第一抗体设立对照。 1.阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组织化学染色。 目的是证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。 2.阴性对照 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。 目的是排除假阳性。 第19页/共65页3.阴性试剂对照 是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂（尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性）而设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。4.自身对照 是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。 第20页/共65页（二）阳性结果阳性细胞的显色可位于细胞膜、细胞质和细胞核 免疫显色强度和阳性细胞密度是定性、定量指标 阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质(浆)型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、片块型等）主要是定位指标哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）也应视为阳性表达第21页/共65页（三）阴性结果 阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而导致阴性反应。（四）特异性显色和非特异性显色的鉴别 1.分布位置 特异性反应必须分布于特定抗原部位 非特异性反应无一定的分布规律 第22页/共65页2.显色强度 特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显色强度不一。阳性细胞的染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔 而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片的细胞 3.其他 在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色 第23页/共65页第24页/共65页六、质量控制 质量控制是免疫组织化学检验技术取得满意结果的必要条件。（一）试剂质量控制 抗体的质量是免疫组织化