高效液相色谱法基本知识培训化验员入门培训.pptVIP

色谱柱 色谱柱是高效液相色谱仪的核心部件，要求分离度高、柱容量大、分析速度快。要达到如此好的性能，不仅与固定相本身的性能有关，而且与色谱柱结构、装填和使用技术等有关。 第六十二页，共一百零四页。 色谱柱填充剂 反相色谱系统使用非极性添充剂，常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等）也有使用,正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。 第六十三页，共一百零四页。 填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含炭量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm（1nm=10埃）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。 除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒度一般在3～10μm之间，粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。 第六十四页，共一百零四页。 色谱柱的使用及保养 1.使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。 2.以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱使用温度，但不宜超过60℃。 第六十五页，共一百零四页。 3.流动相的pH值应控制在2～8之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包裹聚合物填充剂、有机—无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机—无机杂化填充剂等。 第六十六页，共一百零四页。 4.在取得一根新的色谱柱时，应先阅读使用说明。 5.供试品溶液应用0.45μm甚至更小孔径的微孔滤膜过滤，同时应尽可能在色谱柱前使用预柱（微径柱必须使用），可保证供试品溶液中微粒不进入色谱柱，延长色谱柱寿命。 第六十七页，共一百零四页。 6.试验过程中，应避免流动相组成及极性的剧烈变化。 7.试验后，应用适当溶剂冲洗色谱柱，尤其是含有缓冲盐的流动相，应先用含少量有机试剂的水溶液冲洗，再逐步置换到保存色谱柱用有机溶剂。色谱柱冲好后，应用柱塞密封保存，同时注意保存温度。 第六十八页，共一百零四页。 8.色谱柱常见毛病为柱压增高，柱效降低，此时应进行色谱柱维修，一般说明书中会提供色谱柱再生方法，按其操作即可；或者将色谱柱反冲一定时间，若柱压仍不下降，可将色谱柱进口处筛板拆下，用5%稀硝酸超声处理10分钟后再换用纯水超声处理10分钟，同时用相应的固定相修补柱头，最后将筛板装回即可。如果是因为流动相pH值及组成不合适造成固定相流失引起的毛病，则色谱柱基本无法修复。 第六十九页，共一百零四页。 检测器 高效液相色谱法具有高效、高速、高灵敏度的特点。微量组分经色谱柱分离后的检测既不能用人的肉眼也不能分段取样后用仪器检测，只能采用检测器在色谱柱后直接检测。样品组分洗脱液中的浓度或物理量变化，由检测器连续地转换成电信号，在记录仪上迅速地给出直观的信息。操作者可按照所描绘的色谱峰位置来定量地判断分离情况的优劣,并根据峰面积定量地测定各组分的含量。 第七十页，共一百零四页。 最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器、其他常见的检测器有荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 第七十一页，共一百零四页。 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。 第七十二页，共一百零四页。 紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数转换。 第七十三