基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选.pptVIP

2. ?-半乳糖苷酶显色反应选择法 ?-半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝 + 深蓝色 第六十一页，共七十九页。 ?-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。 第六十二页，共七十九页。 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 二、根据插入基因的表型选择 1. 弥补缺陷 his- his+ 受体菌： 外源基因： 在不含组氨酸的培养基中生长 第六十三页，共七十九页。 例：抗生素抗性 抗性基因 载体 外源DNA 连接 转化 受体菌 抗生素培养基平板 含抗生素抗性基因的 克隆才能生长 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 2. 增加新性状 第六十四页，共七十九页。 二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 原生质体转化 碱金属离子介导的完整细胞转化 PEG1000转化法 电击法 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞 第二十九页，共七十九页。 1. 利用原生质体进行转化 酵母 原生质体 感受态 酶去壁 CaCl2 PEG 插入外源基因的载体 共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法 转化 转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响 共转化的原生质体占转化子总数的25%~33% 第三十页，共七十九页。 酵母 0.1mol/L LiCl处理 感受态 2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 插入外源基因的载体 40% PEG 4000 热激 涂布选择性平板，筛选转化子 吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 转化率：103个 / ?g DNA；共转化现象极少 第三十一页，共七十九页。 4. 电击转化 （1）适于原生质体和完整细胞 （2）转化率高，105个 / ?g DNA （3）单链转化率高于双链 3. PEG1000转化 PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化 第三十二页，共七十九页。 二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 载体介导的转化（农杆菌介导） DNA直接导入（基因抢法、电击法等） 种质系统法（花粉管通道法等） （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞 第三十三页，共七十九页。 （二）导入植物细胞 1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法 将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA 第三十四页，共七十九页。 （二）导入植物细胞 1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法 将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌 第三十五页，共七十九页。 （二）导入植物细胞 1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法 通过农杆菌侵染植物外植体 第三十六页，共七十九页。 （二）导入植物细胞 1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法 将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株 第三十七页，共七十九页。 在饲养平皿的滤纸上培养2天 叶盘法的具体操作 第三十八页，共七十九页。 又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。 DNA 1.2?m钨弹头 吸附 金属微粒加速，进入受体细胞 基因枪 装入 2. 基因枪法（gene gun） 外植体制备 轰击 外植体培养及选择 第三十九页，共七十九页。 第四十页，共七十九页。 具体操作 1. DNA微弹的制备 2. 外植体的制备 3. DNA微弹轰击 4. 外植体的培养 第四十一页，共七十九页。 植物细胞 原生质体 纤维素酶和果胶酶 DNA 混合入 电击缓冲液 电击处理 愈伤组织 幼苗 分化 3. 电击法（电穿孔法） 选择培养 第四十二页，共七十九页。 二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 1. 磷酸钙沉淀法 2. 脂质体介导法 3. 显微注射法 4. DEAE-葡萄糖转染法 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞 第四十三页，共七十九页。 原理： （三）导入动物细胞 1. 磷酸钙沉淀法 通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞 依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。 第四十四页，共七十九页。 第四十五页，共七十九页。 操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。 第四十六页，共七十九页。 2. 脂质体介导法 脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。 第四十七页，共七十九页。 第四十八页，共七十九页。 应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。 3. 显微注射法 1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段 2）收集受精卵：受孕后几小时内 3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核 4