儿童紫癜性肾炎血管紧张素原基因多态性分析 .docx

儿童紫癜性肾炎血管紧张素原基因多态性分析 〔〕:摘要：目的讨论焦磷酸测序技术对MUTYH、PIK3C2B、ALDH1L1、TLR1、MAML3、PLG、P、AGT基因的12个位点的基因多态性与儿童紫癜性肾炎的相关性。方法由49例HSPN患儿及21例安康儿童组成，通过外周静脉血提取DNA，经PCR扩增后，通过焦磷酸测序法〔Pyrosequencing法〕对MUTYH、PIK3C2B、ALDH1L1、TLR1、MAML3、PLG、P、AGT基因进展单核苷酸多态性检测。结果HSPN患儿与安康儿童在AGT基因rs699位点CC基因型具有统计学意义〔?2=4.36，P=0.037，P本研究选取了位于MUTYH、PIK3C2B、ALDH1L1、TLR1、MAML3、PLG、P、AGT基因的12个位点进展单核苷酸多态性检测，填补了儿童HSPN在基因研究领域的局部空白。1资料和方法1.1样本来源病例组49例患儿均来源于近年在辽宁中医药大学附属医院门诊就诊患儿，男27人，女22人；平均〔9.552.89〕岁。安康儿童，男14人，女7人；平均〔9.192.56〕岁；HSPN的诊断根据儿童常见肾脏疾病诊治循证指南〔二〕，紫癜性肾炎的诊治循证指南〔试行〕[12]。1.2试剂与仪器1.2.1试剂DNA提取试剂盒：柱式血液基因组DNA抽提试剂盒〔生工生物工程〔上海〕股份〕，PCR：SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，〔生工生物工程〔上海〕股份〕，测序BigDyeTerminatorv1.1、POP-7trade;Polymer、HiDiFormamide，ThermoFisher〔AppliedBiosystemstrade;〕。1.2.2仪器PCR仪、测序仪〔美国ABI〕，凝胶成像仪〔上海复日科技〕，电泳仪〔北京六一仪器厂〕，冰箱〔青岛海尔股份〕。1.3方法1.3.1DNA提取患儿禁食12h后于清晨空腹抽取外周静脉血2mL，搜集于EDTA采血管中，于5分钟内分装同时置于-80℃冰箱内冷冻保存，用于提取DNA。1.3.2由生工生物工程〔上海〕股份应用引物设计软件Premier5软件对rrrs140551047、rs778022672、rs202212492、rs534986978、rs570805279、rs4252128、rs747448179、rs4762、rs699、rs566112479位点完成引物设计。1.3.3PCR反响体系每个扩增反响体系为50?L，10xTaqBuffer〔withMgCl2〕5?L，dNTP〔10mM〕2?L，上下游引物各2?L，Taq酶0.5?L，ddH2O，50?L，模板DNA1~2?L。反响条件：95℃〔5min〕，35x〔94℃30sec，55℃25sec，72℃50sec〕，72℃5min。1.3.4测序1.3.4.1PCR产物纯化及条带切胶回收①准备工作，检查WashSolution中是否已参加乙醇；检查BufferB3中是否已参加异丙醇；检查BufferB3是否出现沉淀。②在PCR反响液中参加5倍体积的BufferB3，充分混匀。③8000xg离心30秒。倒掉搜集管中液体。④参加500?LWashSolution.9000xg离心30秒，倒掉搜集管中液体。⑤重复步骤4一次。⑥空柱于9000xg离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央参加15~40?LElutionBuffer，室温静置1分钟后，离心1分钟，保存管中DNA溶液。1.3.4.2PCR产物的测序PCR反响，标准反响体系为20L，纯化的PCR产物1L，BigDye4L，BigDyeSeqBuffer2L，测序引物1L，灭菌去离子水12L。反响条件：96℃〔1min〕，25x〔96℃10sec，50℃5sec，60℃4min〕4℃。1.3.4.3测序产物纯化〔1〕每96孔依次参加2?L125mMEDTA和2?L3MNaAc到溶液中，再参加50?L100%酒精，盖好，震荡4次，室温15min。〔2〕板式离心机3000xg4℃离心30min；马上倒置96孔板，离心至185xg立即关闭离心机电源，停顿离心。〔3〕加70?L70%酒精，3000xg4℃离心15min；马上倒置96孔板，离心至185xg关闭离心机电源。此步可以重复1次。〔4〕让酒精在室温挥发干净，参加10?LHi-DiFormamide溶解DNA。〔5〕在PCR仪上变性：95℃4min，4℃4min由生工生物工程〔