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产柠檬酸黑曲霉的筛选 组长：高鸿飞 组员：刘光明，何笑军，董慧，王志昆，胡明慧 （西南大学药学院，重庆400716） 【摘要】：以从西南大学各处土壤中分离得到的黑曲霉作为出发菌株，并对其进行了初步分离。利用酸分离法和变色圈法进行初步筛选，以产酸能力的强弱作为复筛指标，筛选到了一株稳定，高产柠檬酸的优势菌株。并利用正交实验法优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培养基，紫外诱变育种法探究高产菌诱变的较佳时间。 【关键词】：黑曲霉；酸分离法；变色圈法；筛选；正交试验；诱变 柠檬酸又名枸椽酸，是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一。产柠檬酸的微生物包括真菌、细菌和酵母，黑曲霉是迄今为止产柠檬酸最佳的微生物之一。本次实验的目的是从土壤中筛选柠檬酸的黑曲霉高产菌株，并对其培养基的配置及最佳产酸条件进行探索，为今后进一步完善和优化其筛选工艺提供一定理论依据。 1材料与方法1.1实验材料1.1.1出发菌种从西南大学食堂周围，山顶，试验田土壤中分离获得。 1.1.2培养基察氏培养基成分硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁（MgSO4-7H2O）0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mL 制法：加热溶解，分装后121°C灭菌20min。1.1.3其他柠檬酸，可溶性淀，Deniges试剂，蔗糖NH4NO3,KH2PO4,MgSO4-7H2O，漠甲酚绿指示剂，氢氧化钠溶液，KMn044溶液1.2实验方法1.2.1黑曲霉筛选的流程土壤-稀释分离-变色圈平板-挑菌-纯化-摇瓶初筛-产物鉴定一复筛一正交实验-最优组合-诱变育种1.2.2黑曲霉的分离与鉴定 采集表层以下5-10cm处土壤，称1.0g土壤迅速倒入装有玻璃珠的无菌水三角瓶中，配成10-2的土壤菌悬液，然后用移液管将其稀释到10-3、10-4、10-5倍。分别吸取10-3、10-4、10-5倍稀释液注入到酸分离培养基上以及涂布到察氏琼脂培养基上，静置5min后倒置于恒温培养箱内35C培养3-4d，观察菌落形态特征，挑选出黑曲霉疑似菌株。1.2.3黑曲霉的初筛将上述所得菌种连续划线接种到初筛培养基平板上，在37C的恒温培养箱培养3-4d后，发现菌落周围有黄色的变色圈（漠甲酚绿指示剂遇酸会产生颜色反应）。快速测定菌落及周围变色圈直径的大小，选择生长较快、变色圈与菌落直径之比相对较大者作为初筛菌株。并利用Deniges试剂（HgO1g溶于20ml0.2L/LH2S04中）鉴定柠檬酸和用0.1429mol/L的NaOH测定产酸量241.2.4黑曲霉的复筛将初筛到的黑曲霉（变色圈明显）接种到摇瓶培养基中，发酵3-5d，重复培养一次。然后用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定10mL的发酵液，记录各自消耗NaOH的体积和计算产酸量。采用正交试验确定培养基浓度。选取四个主要影响因素：蔗糖、NH4NO、KHPO，MgSO4?7HO每个因素各取三个水平，采用四因素三水平进行正交试验L9（34）以优势黑曲霉所产柠檬酸的产酸量为评价指标。这样各个营养成分的浓度也就较为容易地确定下来了。 1.2.5柠檬酸鉴定及产酸量的测定 柠檬酸鉴定 利用Deniges试剂（HgO1g溶于20ml0.2L/LH2S04中）；取过滤液和对照液各约5ml,放入试管内，力加Deniges液lml,在酒精灯上缓缓加热至沸。逐滴加入20g/LKMn04溶液。若有柠檬酸存在，则出现白色沉淀。 产酸量的测定，方法如下： 将过滤液充分摇匀，取10mL于150mL锥形瓶中，滴加2滴酚欧作指示剂，0.1429mol/LNaOH滴定酸度。 1.2.6紫外照射诱变育种 紫外诱变基本流程示意图： 水洗稀释成106个/ml 出发菌株一孢子悬浮液一待处理液紫外线射分离单孢子点种 处理液一平板一培养成熟一平板 选菌摇瓶培养 一培养成熟一测酸度 2结果与分析2.1在初筛培养基上用肉眼观察菌落特征：平板培养基上初为白色、平坦，后中心微隆变黄色，再变棕黑色。培养3-4d后然后挑取平板上单菌落的菌株黑色的孢子丝到显微镜上观察。查文献可知菌丝特点为：初生菌丝为白色，菌丝较长，呈绒毛状；基内菌丝透明，有横隔；部分菌丝特化的壁厚、膨大的足细胞，顶囊明显膨大，多成球形，表面生辐射壮小梗，顶端分生孢子串生。但实验中并未观察到。 2.2黑曲霉的初筛由于初筛培养基中加有漠甲酚绿指示剂，黑曲霉产柠檬酸与之反应，在菌落周围形成一个透明的变色圈。变色圈与菌落直径比例大小对产酸的影响，见表1。 表1变色圈与菌落直径比例大小对产酸的影响 菌落序号 变色圈直径/菌落大小 产酸量 A1 1.7 0.07 A2 2.3 0.15 一般认为，变色圈与菌落直径比例越大，菌株的产酸能力越强。这是因为透明的变色圈是柠檬酸与漠甲酚绿反应的旺盛、产酸能力强。 2.3黑曲霉的复筛 复筛的主要目的