实验四 洋葱内表皮细胞骨架的观察.docxVIP

实验4洋葱内表皮细胞骨架的观察实验目的掌握植物细胞骨架显示的原理和方法，观察光学显微镜下植物细胞骨架的网状结构。实验原理细胞骨架是真核细胞中由纤维蛋白所组成的网状结构，对细胞形态的维持，细胞的生长。运动，分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要的作用，广义的细胞骨架包括细胞质骨架、细胞质骨架，细胞核骨架、细胞外基质四类，而狭义的细胞骨架仅指细胞质骨架。根据其组成成分和形态结构，细胞质骨架可分为微管、微丝和中间丝、目前观察细胞骨架的手段主要有电镜，间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。当用适当浓度的TritonX?-100处理细胞时，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250?染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。微丝、微管和中间丝都是直径很小的结构，最大的单根微管才25mm左右。只能在电镜下才能观察到。本实验用普通光镜观察细胞骨架。是因为骨架纤维成束分布，经染色后，有夸大作用。由于细胞经TrtionX-100抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得之显现更清晰。实验用品一、材料洋葱鳞茎二、器材小烧杯、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、显微镜三、试剂1.?磷酸盐缓冲液6mmol/L,?pH?6.52.?1%TritonX-100 一般配制成?30％储备液，通常将Triton?X-100与M.缓冲液以所需比例混合置于30℃-?40℃水浴中2-3小时，以便液体充分混合均匀。使用时将30%储备液临时稀释成1%3.0.2%考马斯亮蓝R250:46.5ml甲醇、7ml?冰醋酸、46.5ml?蒸馏水。4.?3%戊二醛:用6mmol/L磷酸盐缓冲液配制。5.?M缓冲液:各成分及终浓度如表所示。 实验方法 1.按图所示的方法撕取洋葱鳞茎内表皮细胞(约1cm2大小)，置于装有6mmol/L磷酸盐缓冲液的具塞玻璃瓶中，使其下沉，冲洗。 2.抽提: 吸去磷酸盐缓冲液，用1% TritonX-100处理25min. 3. 冲洗:吸去TritonX-100,用M缓冲液冲洗3次，每次10min. 4. 固定: 3%戊二醛固定30min。 5.冲洗: 6mmol/L 磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次10min. 6. 染色: 0.2%考马斯亮蓝R250染色20min。 7. 制片:用蒸馏水洗1-2次，将标本置于载玻片上，加盖片。 8.观察:光镜下可见表皮细胞的轮廓，细胞内存在着染成蓝色、粗细不等的纤维网络结构，即为构成细胞骨架的微丝束。 作业 1.描绘所观察到的植物细胞的骨架图。 2.显示细胞骨架的原理是什么? 3.说明实验中使用的TritonX-100、戊二醛.考马斯亮蓝R250 的作用。